ACT001通过抑制P65磷酸化降低胶质母细胞瘤细胞程序性死亡蛋白配体1的表达

摘要

目的 探讨新型抗肿瘤药物ACT001对胶质母细胞瘤细胞核因子-κB(NF-κB)信号转导通路活性和细胞程序性死亡蛋白配体1(PDL1)表达的影响.方法 采用生物信息学分析肿瘤基因组学图谱计划(TCGA)和中国脑胶质瘤基因组学图谱计划(CGGA)数据库中胶质瘤患者病理分级和预后与P65和PDL1 mRNA表达量的关系.CCK-8法观察ACT001对U87细胞增殖活性的影响并计算细胞抑制率和ACT001半数抑制浓度,免疫荧光法检测P65蛋白在U87细胞中的定位变化,小干扰RNA(siRNA)转染U87细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测P65蛋白敲低效率,Western blotting法检测不同转染组和不同浓度药物处理组P65、磷酸化P65(p-P65)和PDL1相对表达量.结果 (1)生物信息学分析显示,胶质瘤患者P65和PDL1 mRNA表达量随肿瘤病理分级的升高而呈上升趋势(均P＜0.05),且P65和PDL1高表达组生存率和总生存期均低于低表达组(均P＜0.05).(2)细胞增殖活性检测显示,经不同药物浓度ACT001(5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)处理后,U87细胞抑制率分别为(9.01±4.75)％、(17.03±2.91)％、(28.50±4.85)％、(45.50±5.15)％、(67.67±8.46)％、(83.02±5.79)％和(94.33±1.59)％,ACT001对U87细胞的半数抑制浓度为42.98 μmol/L.(3)免疫荧光法显示,经50 μmol/L ACT001处理的U87细胞P65蛋白入核减少.(4) qRT-PCR法显示,不同siRNA转染组U87细胞P65 mRNA表达量差异有统计学意义(F=164.200,P=0.000),其中si-P65-1组(t=13.290,P=0.000)和si-P65-2组(t=12.730,P=0.000) P65 mRNA表达量均低于si-NC组.(5)Western blotting法显示,不同siRNA转染组U87细胞P65(F=681.300,P=0.000)、p-P65(F=128.800,P=0.000)和PDL1 (F=20.470,P=0.002)相对表达量差异有统计学意义,其中si-P65-1组和si-P65-2组P65(t=59.630,P=0.000;t=29.380,P=0.000)、p-P65(t=24.370,P=0.000;t=13.460,P=0.000)和PDL1(t=6.025,P=0.004;t=6.728,P=0.003)相对表达量均低于si-NC组.(6)不同浓度药物处理组U87细胞p-P65 (F=269.700,P=0.000)和PDL1(F=128.800,P=0.000)相对表达量差异有统计学意义,其中ACT00125μmol/L组和50 μmol/L组p-P65(t=19.750,P=0.000;t=24.640,P=0.000)和PDL1(t=12.690,P=0.000;t=19.230,P=0.000)相对表达量均低于正常对照组,ACT00150 μmol/L组亦低于25 μmol/L组(t=5.288,P=0.006;t=2.868,P=0.046).结论 ACT001不仅可以抑制U87胶质瘤细胞的增殖,还可以通过抑制P65的磷酸化及核转位,从而抑制PDL1的表达,以改善胶质瘤的免疫抑制微环境,进而抑制胶质母细胞瘤进展.