小鼠出生后早期心脏成纤维细胞数量及性状变化研究

摘要

目的 心脏成纤维细胞占心脏细胞数量的50％以上,在心脏生理病理过程中发挥重要作用.小鼠出生后7d是心脏失去再生能力的时间转折点,本研究着眼于研究心脏成纤维细胞在小鼠出生后早期数量及性状的变化情况,为心肌再生机制研究提供基础性实验数据.方法 出生1 d和7 d的C57小鼠进行心尖切除手术(Apex resection,AR),体视镜拍照及HE染色观察心尖处切口,21 d后观察再生情况;分离出生后1 d和7 d的C57小鼠心脏组织,称取心脏湿重比较重量差异,病理切片进行HE染色观察两个时间点的心脏病理结构,免疫荧光染色观察1d和7d心脏组织中成纤维细胞数量变化;为了更加准确定量心脏成纤维细胞的数量变化,我们利用成纤维细胞表面标志物胸腺细胞分化抗原1(Thymocyte differentiation antigen 1,Thy1)通过流式分选技术对心脏组织细胞悬液进行心肌成纤维细胞的分选,比较1d和7d小鼠心脏组织中心肌成纤维细胞比例;为了验证心脏成纤维细胞性状是否发生变化,我们分离1 d和7 d小鼠心脏成纤维细胞,分析成纤维细胞的特异性标志物Thy1、成纤维细胞特异性蛋白(Fibroblast-specific protein 1,Fsp-1)、骨膜蛋白(Periostin)、血小板衍生生长因子受体 α(platelet-derived growth factor receptorα,Pdgfrα)、Ⅰ型胶原α1(Collagen alpha-1,Col1a1)、转录因子21(Transcription factor 21,Tcf21)在mRNA水平的表达变化情况.结果 出生1 d的小鼠心尖切除手术后21 d可以完全再生(再生率为86.67％),而7 d小鼠手术后不能完全再生(再生率为0);小鼠出生后7 d心脏组织平均比1 d心脏湿重重13.13 mg(3.11倍)(1 d:(6.22±0.19),7 d:(19.35±0.56),P<0.0001;n=6).心脏成纤维细胞免疫荧光染色证明,7 d心脏成纤维细胞数量明显高于1d心脏;流式细胞分选证明小鼠出生后7d心脏组织中心肌成纤维细胞占总细胞比例比出生后1 d时高2.9％(1.38倍)(1 d:(7.7±0.74),7 d:(10.6±0.95),P=0.029;n=3);在成纤维细胞转录水平,成纤维细胞标志蛋白Thy1、Fsp-1、Periostin在小鼠出生后7 d表达高于出生后1 d的成纤维细胞(Thy1:1 d:(1.01±0.12),7 d:(2.71±0.27),P=0.0288;Fsp-1:1 d:(1.04±0.27),7 d:(5.28±0.10),P=0.0046;Periostin:1 d:(0.91±0.01),7 d:(1.13±0.05),P=0.0119;n=3),而Pdgfrα、Col1a1、Tcf21三种成纤维细胞标志蛋白表达则低于出生后1 d的小鼠心脏中的成纤维细胞(Pdgfrα:1 dL:(1.09±0.04),7 d:(0.62±0.01),P=0.0068;Col1a1:1 d:(1.00±0.09),7 d:(0.57±0.02),P=0.0433;Tcf21:1 d:(1.00±0.03),7 d:(0.54±0.02),P=0.0054;n=3),证明出生后1d到7d的过程中心脏成纤维细胞性状发生了变化.结论 小鼠出生后早期(1d和7d)心脏成纤维细胞的比例和性状均发生了明显变化,为研究哺乳动物心肌再生能力的丢失的机制研究提供一定的线索.