基于miRNA-30的RNAi表达框架的构建及其有效性验证

摘要

目的 构建基于人源性miRNA-30,针对EGFP基因的RNAi表达框架并验证其有效性.方法 融合PCR构建RNAi表达框架,经凝胶电泳、测序比对及二级结构预测后,将该表达框架与pEGFP-N2质粒共转染A549、HCT116及HEK-293细胞,48 h后倒置荧光显微镜观察EGFP的表达情况并用流式细胞仪检测平均荧光强度.结果 凝胶电泳和测序比对均显示RNAi表达框架与设计的相符,二级结构预测显示,新型RNAi表达框架与人源性miRNA-30的二级结构高度相似;共转染该表达框架与pEGFP-N2质粒48 h后,倒置荧光显微镜观察结果显示,3种细胞的荧光强度均明显减弱,流式细胞仪检测结果显示,3种细胞中共转染组与单独转染组相比平均荧光强度的差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 新型RNAi表达框架构建成功,且能有效干扰EGFP在A549,HCT116和HEK-293细胞中的表达.