水稻OsTOM1-RNAi载体与表达OsTOM1-RNAi转基因水稻的构建

摘要

通过在Genebank中搜索到与拟南芥中支持烟草花叶病毒复制的基因AtTOM1序列具部分同源的水稻EST序列AU173304(gi∶12623091)。用特异性引物和RACE方法克隆水稻OsTOM1基因全长序列和全长cDNA序列。水稻OsTOM1基因长7140个碱基对，11个外显子，10个内含子。其全长cDNA有1341个碱基对，含有一个从第156bp开始至1062bp长906个碱基对的开放阅读框，5'端非编码区有155个碱基对；3'端非编码区有279个碱基。编码302个氨基酸。并且在此基础上构建了RNAi和反义RNA表达载体。利用农杆菌EHA105将其导入水稻台北309的愈伤组织中，最终共获得了12株带G418抗性标记的转基因植株。PCR检测表明外源基因已整合入水稻染色体上。为进一步的OsTOM1基因功能研究和抗病毒转基因水稻的获得奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1水稻病毒病

1.2常用的植物转基因方法

1.2.1基因枪介导转化法

1.2.2农杆菌介导转化法

1.2.3病毒载体介导法

1.2.4花粉管通道法

1.3植物抗病转基因工程研究进展

1.3.1转基因作物产业发展迅速

1.3.2植物抗病毒生物技术的策略

1.4植物RNA病毒寄主因子的研究进展

1.5 RNA诱导的基因沉默

1.5.1反义RNA技术

1.5.2 RNAi技术

1.5.3病毒诱导的基因沉默(virus一induced gene silencing，VIGS)

1.6本研究的目的及意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1水稻品种

2.1.2菌株与质粒

2.1.3常用培养基

2.1.4酶、PCR引物和化学试剂

2.2分子生物学操作

2.2.1质粒DNA的提取

2.2.2 其它分子生物学操作

2.2.3三亲结合法向农杆菌导入目的质粒

2.3水稻的遗传转化

2.3.1水稻愈伤组织的获得

2.3.2水稻愈伤组织的继代培养

2.3.3共培养

2.3.4筛选培养

2.3.5分化培养

2.3.6生根培养

2.4转基因的水稻的PCR检测

2.4.1水稻总DNA的提取

2.4.2转基因植株的PCR检测引物设计

2.4.3 PCR产物的测序

第三章结果与分析

3.1水稻OsTOM1基因全长cDNA的克隆

3.2水稻OsTOM1基因RNAi表达质粒的构建

3.2.1水稻OsTOM1基因RNAi克隆质粒的构建

3.2.2水稻OsTOM1 RNAi表达质粒的构建

3.2.3水稻OsTOM1 RNAi表达质粒导入农杆菌EHA105

3.3全长OsTOM1基因正义及反义表达载体的构建

3.4表达OsTOM1-RNAi转基因水稻台北309的构建

3.4.1抗性愈伤组织的筛选

3.4.2拟转基因水稻植株的获得

3.5转基因TP309 T0代的鉴定

3.5.1台北309转基因植株的PCR检测

3.5.2 PCR产物序列的测定和对比

3.6转基因植株的T1代遗传分析

第四章讨论

4.1水稻OsTOM1基因

4.2水稻组织培养中的一些细节处理技术

4.3结论

第五章参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况