应用抑制性消减杂交技术分离E1A药敏相关基因

摘要

背景与目的:大量研究已经证明,腺病毒5型E1A基因能抑制肿瘤的生长和转移,逆转其恶性表型,特别是能提高肿瘤细胞对多种化疗药物的敏感性,对射线也具有明显的增敏作用。但E1A基因通过哪些基因发挥作用还不知道。本研究利用抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)技术在药物敏感的肿瘤细胞中分离差异表达的E1A药敏相关基因。方法:以E1A蛋白处理的人头颈淋巴结转移肿瘤细胞LN686为实验组,以亲本LN686细胞为对照组,提取mRNA,构建消减cDNA文库。随机挑取克隆,采用斑点杂交技术鉴定差异基因片段的表达水平,分析所获cDNA核苷酸序列,并在GenBank中进行比较,半定量RT-PCR鉴定实验组和对照组中新基因的mRNA水平。结果:文库包含约7000个阳性克隆,随机挑取384个克隆进行PCR鉴定,其中362个有插入片段,通过斑点杂交技术,证实这些基因在实验组中表达水平较对照组显著提高。将这362个克隆进行测序并经过BLAST分析,表明10个为新基因,已在GenBank中登录。对其中7个新基因进行半定量RT-PCR检测,证明经E1A蛋白处理的LN686细胞中,新基因的表达水平明显高于亲本LN686细胞,相差3～8倍。结论:应用抑制性消减杂交技术筛选到10个新基因片段,为进一步克隆其全长基因、研究其功能打下基础。