不同三维多孔结构对人工真皮血管化速率影响的实验研究

摘要

目的 探索定向排列的三维多孔网状(A型)结构和蜂窝煤状垂直贯穿的三维多孔网状(B型)结构对人工真皮血管化速率的影响.方法 采用实验研究方法.本研究中的人工真皮为硅胶层和支架层双层结构,根据支架层结构不同,分为含A型结构和B型结构的人工真皮(以下分别简称A型真皮、B型真皮),其中的A型结构和B型结构分别采用梯度冷冻干燥技术和物理制孔技术制得.采用扫描电镜观测2种真皮支架的微观形貌.采用比重瓶法测定2种真皮支架的孔隙率.参照国家医药行业标准中的方法,于降解4、8、13、24 h测定2种真皮降解液及残留物中羟脯氨酸的含量,反映2种真皮降解率.取L929细胞,按照随机数字表法分为A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组、阳性对照组,阳性对照组加入含体积分数5％二甲基亚砜的MEM培养基,阴性对照组加入高密度聚乙烯浸提液,其余2组加入相应的浸提液培养24 h,采用噻唑蓝试剂测定细胞增殖率,并对细胞毒性进行定级.取L929细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),接种于预先置有2种真皮的孔板.接种后1、4、7、14d,采用免疫荧光法检测L929细胞在2种真皮支架表面的黏附生长状况.接种后7d,采用免疫荧光法和苏木精-伊红(HE)染色法检测前述2种细胞长入2种真皮支架的情况.在3只6个月龄雄性巴马小型猪背部两侧各制作3个5.0 cm×5.0 cm的全层皮肤缺损创面,6列创面按照随机数字表法分为A型真皮两步法组、B型真皮两步法组和B型支架一步法组.A型真皮两步法组和B型真皮两步法组的创面分别先行A型真皮或B型真皮移植后,再行自体刃厚皮片的移植,B型支架一步法组的创面行B型真皮(揭除硅胶层)+自体刃厚皮片一步法移植.大体观察Ⅱ期术后7dA型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14dB型支架一步法组的猪背创面出血、渗液和感染情况.同时,采用透明胶片网格法测定自体皮移植面积并计算其存活率.Ⅰ期术后4、7、14d,HE染色法检测3组猪背创面中支架的炎症细胞、成纤维细胞(Fb)和毛细血管浸润情况.Ⅰ期术后7d,免疫组织化学法进一步检测3组猪背创面中支架的血管化情况.Ⅰ期术后28 d、3个月,HE染色法检测A型真皮两步法组和B型支架一步法组猪背创面中支架的降解情况.对数据行单因素方差分析、独立样本t检验、Bonferroni校正.结果 A型真皮支架表面均匀分布着大量圆形和椭圆形的微孔,纵切面可观察到柱状孔壁大体呈平行定向排列;B型真皮支架表面的蜂窝煤状贯穿大孔呈矩阵有序排列,纵切面蜂窝煤状贯穿孔的孔壁由微孔相互连通成网络结构.A型真皮支架的孔隙率为(93.2±0.7)％,与B型的(95.9±1.0)％相近(t=4.653,P＞0.05).A型真皮在4、8、13、24 h的降解率与B型真皮对应时间点的降解率相近(t=0.232、0.856、0.258、7.716,P＞O.05).培养24 h,A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组L929细胞的增殖率显著高于阳性对照组(t=2393.460、2538.270、1077.770,P＜0.01);阳性对照组细胞毒性评级为4级,其余3组为0级.接种后1、4、7、14d,L929细胞和HUVEC在2种真皮支架中均呈时间依赖性增殖;且2种细胞在B型真皮上的黏附生长、增殖速率高于A型真皮.接种后7d,L929细胞和HUVEC均已长满B型真皮支架层且至硅胶层一侧;而前述2种细胞向A型真皮内部迁移速度较慢,硅胶层一侧仅见少量细胞.Ⅱ期术后7dA型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14dB型支架一步法组创面均未出现出血、渗液、感染等情况;3组各6个创面的自体皮植皮存活率均为100％.Ⅰ期术后4、7、14d,炎症细胞、Fb、毛细血管等逐渐向创面的支架层浸润,且细胞浸润速率从高到低依次为B型支架一步法组、B型真皮两步法组、A型真皮两步法组.Ⅰ期术后7d3组创面中支架的血管化速率从高到低依次为B型支架一步法组、B型真皮两步法组、A型真皮两步法组.B型支架一步法组猪背创面中的支架在术后28 d逐渐溃散,术后3个月完全降解;A型真皮两步法组猪背创面中的支架降解情况与前述相似.结论 与A型结构相比,B型结构可加速人工真皮支架血管化进程,利于联合自体刃厚皮一步法移植修复猪全层皮肤缺损创面.一步法移植的效果与分次移植人工真皮与自体刃厚皮的两步法一致,可为创面治疗提供更优选择.