体外研究瞬时受体电位香草酸亚型1对缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制

摘要

目的 初步探讨瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）对体外培养的缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制。方法 取120只1～2 d龄雌雄不拘C57BL/6小鼠,分离心脏培养原代心肌细胞,并进行如下实验,分组方法均按照随机数字表法。（1）将细胞分为常氧组及缺氧3、6、9 h组,每组1孔。常氧组细胞行常规培养（下同）,缺氧3、6、9 h组细胞采用不含胎牛血清的DMEM无糖培养基于体积分数1%氧气、5%二氧化碳、94%氮气的低氧条件下分别培养3、6、9 h。蛋白质印迹法检测微管相关蛋白1轻链3（LC3）、Beclin-1及TRPV1的蛋白表达。（2）将细胞分为常氧组和缺氧组,每组2张盖玻片,其中缺氧组细胞同前缺氧处理6 h。免疫荧光法检测TRPV1的阳性表达。（3）将细胞分为4组,每组1孔。单纯缺氧组细胞同前行缺氧处理6 h；缺氧＋0.1 μmol/L辣椒素组、缺氧＋1.0 μmol/L辣椒素组、缺氧＋10.0 μmol/L辣椒素组细胞分别加入0.1、1.0、10.0 μmol/L辣椒素处理30 min后,行缺氧处理6 h。蛋白质印迹法检测LC3、Beclin-1及TRPV1的蛋白表达。（4）将细胞分为5组,每组5孔。缺氧组细胞同前缺氧处理6 h；缺氧＋氯喹组、缺氧＋辣椒素组、缺氧＋辣椒素＋氯喹组细胞分别加入50 μmol/L氯喹、10.0 μmol/L辣椒素、50 μmol/L氯喹＋10.0 μmol/L辣椒素处理30 min后缺氧处理6 h。细胞计数试剂盒8法检测细胞活力。（5）将细胞分为单纯缺氧组及缺氧＋10.0 μmol/L辣椒素组,每组1孔,前者细胞同前缺氧处理6 h；后者细胞加入10.0 μmol/L辣椒素处理30 min后,行缺氧处理6 h。蛋白质印迹法检测溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1）、LAMP-2的蛋白表达。各实验重复3次或5次。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果 （1）与常氧组比较,缺氧3、6、9 h组心肌细胞中LC3、Beclin-1、TRPV1蛋白表达明显增高（t3 h＝4.891、5.890、4.928,t6 h＝9.790、6.750、10.590,t9 h＝6.948、6.764、5.049,P＆0.05或P＆0.01）；缺氧6 h组3种蛋白表达最高,分别为1.08±0.05、1.12±0.10、0.953±0.071。（2）缺氧组TRPV1在心肌细胞膜和胞内密度明显增加,呈团块状分布,表达明显强于常氧组。（3）与单纯缺氧组比较,缺氧＋0.1 μmol/L辣椒素组心肌细胞中Beclin-1蛋白表达明显增高（t＝10.488,P＆0.01）,LC3和TRPV1蛋白表达虽增高但差异无统计学意义（t＝4.372、3.026,P＆0.05）；缺氧＋1.0 μmol/L辣椒素组、缺氧＋10.0 μmol/L辣椒素组心肌细胞中LC3和TRPV1、Beclin-1蛋白表达均明显增高（t＝15.505、5.773、13.430,20.915、8.054、16.384,P＆0.05或P＆0.01）,其中缺氧＋10.0 μmol/L辣椒素组3种蛋白表达均达峰值,分别为2.33±0.09、1.34±0.07、1.246±0.053。（4）与常氧组（0.585±0.045）比较,缺氧组心肌细胞活力明显下降（0.471±0.037,t＝4.365,P＆0.05）；与缺氧组比较,缺氧＋氯喹组心肌细胞活力进一步明显下降（0.350±0.023,t＝6.216,P＆0.01）,缺氧＋辣椒素组心肌细胞活力则明显升高（0.564±0.047,t＝3.489,P＆0.05）；与缺氧＋氯喹组比较,缺氧＋辣椒素＋氯喹组心肌细胞活力无明显变化（0.364±0.050,t＝0.545,P＆0.05）。（5）与单纯缺氧组（0.99±0.04、0.54±0.04）比较,缺氧＋10.0 μmol/L辣椒素组心肌细胞中LAMP-1和LAMP-2蛋白表达明显增加（1.49±0.06、0.81±0.05,t＝12.550、7.442,P＆0.01）。结论 TRPV1通过自噬-溶酶体途径进一步促进缺氧早期小鼠心肌细胞自噬相关蛋白的表达,增强自噬活性,改善自噬流,减轻早期缺氧心肌细胞的损伤。