γ干扰素对瘢痕疙瘩成纤维细胞转化生长因子β/Smad信号通路的作用

摘要

目的了解γ干扰素（IFN-γ）对瘢痕疙瘩Fb（KFb）中TGF-β/Smad信号通路的作用,探讨IFN-γ治疗病理性瘢痕的可能机制。方法切取3例患者的瘢痕组织,体外分离培养KFb,实验选用第3～5代细胞。（1）将KFb分为:对照组,加无血清DMEM培养;TGF-β1组,用10 ng/mL的TGF-β1单独作用;IFN-γ组,用100 ng/mL的IFN-γ单独作用;TGF-β1+IFN-γ组,10 ng/mL的TGF-β1与100 ng/mL的IFN-γ联合作用。采用实时荧光定量RT-PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光细胞化学染色法,分别检测结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA、蛋白表达,以及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的蛋白表达与阳性细胞表达情况。（2）另取KFb,用10 ng/mL的IFN-γ作用,于作用前及作用后30 min和1、2、4、6、8 h通过实时荧光定量RT-PCR检测Smad 3和Smad 7的mRNA表达,于作用前及作用后1、2、4、6、8 h用蛋白质印迹法检测Smad 3和Smad 7的蛋白表达。（3）另取KFb,根据添加的IFN-γ终浓度不同分为1、10、100 ng/mL IFN-γ组,均作用4 h;设立未添加IFN-γ的KFb为对照组。同前检测各组Smad 3和Smad 7的mRNA及蛋白表达。结果 （1）IFN-γ组KFb CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.017±0.009与1.198±0.004,较对照组（0.024±0.013与1.229±0.011）显著减少（P＜O.05）;TGF-β1+IFN-γ组CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.634±0.138与1.204±0.010,较TGF-β1组（1.331±0.298与1.727±0.004）显著减少（P＜0.01）。IFN-γ组KFb中,α-SMA阳性细胞荧光强度（0.922±0.059）和α-SMA蛋白表达量（0.3051±0.0031）较对照组（1.055±0.005与0.4513±0.0094）显著减少（P＜0.01）;TGF-β1+IFN-γ组α-SMA阳性KFb荧光强度（1.129±0.004）和α-SMA蛋白表达量（0.6734±0.0098）较TGF-β1组（1.270±0.005与1.3842±0.0024）显著减少（P＜0.01）.（2）10 ng/mL IFN-γ作用后第1个时相点,Smad 3的mRNA和蛋白表达量均出现一过性增高,随后降低,mRNA表达量于作用后4 h降至最低点,随后缓慢上升,至作用后8 h仍低于作用前（P＜0.01）;其蛋白表达量于作用后2～8 h显著低于作用前（P＜0.01）。而Smad 7的mRNA和蛋白表达量在INF-γ作用后逐渐增高,分别于作用后2、4 h达峰值随后降低,至作用后8 h仍高于作用前（P＜0.05）。（3）与对照组比较,1、10、100 ng/mL IFN-γ组Smad 3的mRNA及蛋白表达量显著减少（P＜0.05或P＜0.01）,Smad 7的mRNA及蛋白表达量显著增加（P＜0.05或P＜0.01）,且随IFN-γ浓度升高,减少或增高幅度愈为显著。结论 IFN-γ可呈时间和剂量依赖方式下调Smad 3、上调Smad 7,降低基础状态下或经TGF-β1诱导后KFb的CTGF和α-SMA表达量,表现出对TGF-β/Smad信号通路的显著拮抗作用,这可能是IFN-γ治疗病理性瘢痕的重要机制。