香烟烟雾提取物刺激下微小RNA-146a对人肺腺癌A549细胞中Fas相关因子2及炎症因子的影响

摘要

目的以烟雾吸入性损伤为前提,探讨在香烟烟雾提取物（CSE）刺激下转染微小RNA-146a对人肺腺癌A549细胞中Fas相关因子2（FAF-2）及炎症因子的影响。方法（1）构建pMIR-FAF-2重组质粒、pMIR-FAF-2重组突变质粒。将第3代人胚胎肾293（HEK-293）细胞按随机数字表法分为3组,每组5孔:质粒+微小RNA对照组,转染pMIR-FAF-2重组质粒、pRL-TK质粒及微小RNA对照剂;质粒+微小RNA-146a组,转染pMIR-FAF-2重组质粒、pRL-TK质粒及微小RNA-146a模拟物;突变质粒+微小RNA-146a组,转染pMIR-FAF-2重组突变质粒、pRL-TK质粒及微小RNA-146a模拟物。培养24 h后,采用双荧光素酶报告基因检测细胞相对荧光素酶活性。（2）将第3代A549细胞按随机数字表法分为3组,每组4孔:微小RNA对照组,转染微小RNA对照剂;微小RNA-146a增强组,转染微小RNA-146a模拟物;微小RNA-146a抑制组,转染微小RNA-146a抑制剂。培养24 h后,采用实时荧光定量RT-PCR法检测细胞微小RNA-146a表达及FAF-2的mRNA表达。（3）将第3代A549细胞同实验（2）分组及处理24 h后,采用体积分数0.8%的CSE刺激24 h。采用实时荧光定量RT-PCR法检测细胞FAF-2、IL-8、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、生长调节致癌基因α（GRO-α）的mRNA表达量,ELISA法检测细胞培养上清液中IL-8、MCP-1、GRO-α的蛋白表达量,采用蛋白质印迹法检测环氧化酶2（COX-2）的蛋白表达量。对数据行单因素方差分析、LSD检验。结果（1）pMIR-FAF-2重组质粒、pMIR-FAF-2重组突变质粒确认构建成功。质粒+微小RNA对照组与突变质粒+微小RNA-146a组HEK-293细胞相对荧光素酶活性相近（P＞0.05）,质粒+微小RNA-146a组HEK-293细胞相对荧光素酶活性明显低于质粒+微小RNA对照组和突变质粒+微小RNA-146a组（P值均小于0.01）。（2）微小RNA对照组与微小RNA-146a抑制组A549细胞微小RNA-146a表达量相近（P＞0.05）,均明显低于微小RNA-146a增强组（P值均小于0.01）。微小RNA对照组和微小RNA-146a抑制组A549细胞FAF-2的mRNA表达量相近（P＞0.05）,均明显高于微小RNA-146a增强组（P值均小于0.05）。（3）CSE刺激后,微小RNA对照组与微小RNA-146a抑制组A549细胞FAF-2的mRNA表达量分别为1.46±0.21和1.43±0.34,二者相近（P＞0.05）,均明显高于微小RNA-146a增强组的0.57±0.11（P值均小于0.05）。微小RNA-146a增强组A549细胞IL-8、MCP-1、GRO-α的mRNA表达量均明显低于微小RNA对照组和微小RNA-146a抑制组（P值均小于0.01）,微小RNA-146a抑制组A549细胞IL-8、MCP-1、GRO-α的mRNA表达量明显高于微小RNA对照组（P值均小于0.05）;微小RNA-146a增强组A549细胞培养上清液中IL-8、MCP-1、GRO-α的蛋白表达量均明显低于微小RNA对照组和微小RNA-146a抑制组（P值均小于0.05）;微小RNA-146a抑制组A549细胞培养上清液中IL-8蛋白表达量与微小RNA对照组相近（P＞0.05）,MCP-1、GRO-α蛋白表达量明显低于微小RNA对照组（P值均小于0.05）。微小RNA-146a增强组A549细胞COX-2蛋白表达量明显低于微小RNA对照组和微小RNA-146a抑制组（P值均小于0.05）,微小RNA对照组A549细胞COX-2蛋白表达量与微小RNA-146a抑制组相近（P＞0.05）。结论 CSE刺激下转染微小RNA-146a的A549细胞中,微小RNA-146a可通过与靶基因FAF-2的3′端非翻译区结合,降低FAF-2的表达,从而降低炎症因子表达量。