苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

摘要

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种(subsp.Leesis)菌株YBT-833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai)菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp.Kurstaki)菌株YBT-1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位.结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA片段上.将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库.通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序.DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基.将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌-大肠杆菌穿梭载体pHT315,分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902.将它们电转化到vip-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7.SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达.生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC50值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL.该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据.