基因工程酶法结合酵母能量耦联高效合成L-谷氨酰胺的研究

摘要

通过PCR方法从Bacillus subtilis基因组DNA中扩增出谷氨酰胺合成酶基因(glnA),克隆至表达载体pET28b,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG及乳糖诱导表达.SDS-PAGE分析表明,所表达的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,简称GS)为可溶性蛋白,约占总菌蛋白的80%.利用表达的GS蛋白N端的6×His-Tag对GS进行亲和层析,将获得的纯蛋白进行酶活性测定.结果表明,纯化的GS合成反应的最适温度为60℃,最适pH为6.5,Mn2+能明显提高GS的活性和稳定性.工程菌BL21(DE3)/pET28b-glnA粗提物中GS的比活是宿主菌本身的84倍.以谷氨酸、NH4Cl和ATP为底物的转化实验表明谷氨酸的转化率达95%以上.经筛选获得一株高效能量耦联酵母菌株,命名为YC001;通过能量耦联表明,该系统对谷氨酸的转化率高达80%,平均谷氨酰胺产量为22g/L.