利用Cre/LoxP系统删除转基因山羊体内的选择标记基因

摘要

在制备转基因家畜过程中的一个关键步骤是使用选择标记基因(Selectable marker genes,SMGs)将转基因整合细胞从大量的正常细胞中筛选出来,这导致了SMGs整合入家畜的基因组内持续传递给后代.SMGs已被证明能够显著影响基因组内整合位点处的基因调控,也增加了对转基因动物安全评价的复杂性.为了确定转基因山羊制备过程中SMGs的删除时机和删除方法,在体细胞克隆前后两个时段内,利用Cre/LoxP系统删除SMGs的可行性,同时比较了蛋白转导和质粒共转染两种Cre导入方式的删除效率.结果表明:尽管在首次对山羊成纤维细胞进行遗传修饰后即可进行SMGs删除,但两次遗传修饰导致细胞严重老化,无法用于后续的体细胞克隆羊制备.在转基因山羊的成体细胞中删除SMGs不存在上述问题,成功率高,缺点是试验周期长、耗资增大.Cre表达质粒瞬时转染能够删除SMGs,但有超过30％的无SMGs细胞克隆中整合有质粒序列.TAT-CRE蛋白质转导方法可以避免引入的新外源基因,SMGs删除率达到43.9％～72.8％,是一种较佳的SMGs删除手段.