绒山羊细菌人工染色体重组及细胞转染系统

摘要

绒山羊(Cashmere goat)是一类以生产山羊绒为主的山羊品种,因其绒毛纤细有光泽、轻盈、保暖而备受青睐.绒山羊角蛋白关联蛋白(Keratin associated protein,KAP)和骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)在羊绒纤维毛囊细胞的增殖和分化过程中起重要作用.为了提高山羊绒的产量和品质,对包含kap6.3,kap8.1和bmp4基因的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)进行研究.首先采用同源重组的方法对BAC进行修饰,其次将哺乳动物密码子优化过的To12转座子加入BAC中,最后采用AmaxaNucleofector核转染技术将修饰过的BAC转入绒山羊成纤维细胞.结果表明成功构建了含有目的基因的BAC-Tol2载体.载体上包含UBC启动元件的egfp标记基因和真核筛选抗性neo基因,并且载体的两端加有loxp元件,为转染细胞后标记和抗性基因的去除作准备.载体转染细胞效率达到1％-6％,最高可达10％.成功获得了外源整合kap6.3、kap8.1和bmp4基因的细胞株,为以后克隆绒山羊作准备.研究表明,在BAC的修饰中应用To12转座子系统增加了电转染后的整合率,提高了BAC无错重组的效率和精确性.