来源于泗阳鞘氨醇杆菌的聚磷酸激酶的克隆表达及在ATP再生系统中的应用

摘要

聚磷酸激酶（polyphosphate kinase, PPK）在体外催化合成ATP的反应中有着重要作用。为寻找能利用短链聚磷酸盐（polyphosphate, polyP）为底物高效合成ATP的聚磷酸激酶，本文以来源于泗阳鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumsiyangensis）的聚磷酸激酶（PPK2）为研究目标，利用pET-29a构建重组质粒，在大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）中表达，并将其作为ATP再生系统的关键酶与L-氨基酸连接酶（YwfE）联用生产丙谷二肽（Ala-Gln）。ppk2长度为810bp，编码270个氨基酸；SDS-PAGE结果表明PPK2为可溶性表达，分子量为29.7 kDa。对PPK2的最适反应条件进行了优化，结果发现其在22–42℃、pH7–10的范围内均可以保持较好活性，且在37℃、pH为7、镁离子（Mg2+）浓度为30 mmol/L、底物ADP与六偏磷酸钠浓度分别为5 mmol/L和10 mmol/L时酶活最大，在0.5 h时ATP产率可以达到理论值的60%以上。作为模式反应体系，当PPK2与YwfE联用生产Ala-Gln时，达到与直接添加ATP相同的效果。此聚磷酸激酶作为ATP再生系统具有较好的适用性，适用的温度和pH范围广，且能以廉价易得的短链polyP为底物高效合成ATP，为依赖ATP的催化反应体系的能量再生提供了新酶的来源。