基质金属蛋白酶-2/9敏感型可跨膜融合抗氧化酶的表达、纯化和表征（英文）

摘要

融合了跨膜肽的抗氧化酶可进入细胞，保护细胞免受放射损伤。然而跨膜肽的跨膜能力没有靶向性，其也可把抗氧化酶带入肿瘤细胞进而保护肿瘤细胞，降低放疗的效果。为此，根据多数肿瘤细胞微环境中存在活性基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2或MMP-9的特点，在细胞跨膜肽R9与人铜、锌超氧化物歧化酶（superoxide dismutase 1,SOD1）和谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）之间融合MMP-2/9的底物肽X，设计了融合蛋白GST-SOD1-X-R9。该蛋白在肿瘤微环境中可因MMP-2/9酶切底物肽X而失去跨膜肽，从而无法进入肿瘤细胞，进而只能进入正常细胞。全基因合成SOD1-X-R9序列，并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中，得到表达质粒，并实现了GST-SOD1-X-R9融合蛋白的可溶表达。GST-SOD1-X-R9经硫酸铵沉淀和GST亲和层析纯化，分子量约为47 kDa，与理论值一致。纯化的融合蛋白的SOD活性和GST活性分别为2 954 U/mg和328 U/mg。GST-SOD1-X-R9的SOD活性或GST活性在生理条件下几乎没有变化。该融合蛋白在溶液中可被胶原酶Ⅳ部分水解。分别建立了2D和3D培养的HepG2细胞模型来检验肿瘤微环境中的MMP-2活力对该蛋白跨膜能力的影响。在2D培养模型中，HepG2的MMP-2活力极低，但在3D培养模型中，随着培养时间的增加，HepG2肿瘤球的体积变大，其胞外MMP-2活力也随之增强。GST-SOD1-X-R9在2D培养的HepG2细胞中具有和GST-SOD1-R9蛋白一样的跨膜效率，但在3D培养的HepG2细胞球中的跨膜能力大大降低。本研究为后续深入研究GST-SOD1-X-R9靶向防护正常细胞的氧化损伤效应奠定了基础。