定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子BA-ELISA方法的建立与评价

摘要

目的:建立一种定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)方法并评价其可靠性.方法:优选设计CFTR三个表位的大肠杆菌表达抗原,免疫新西兰白兔获得CFTR多克隆抗体,用纯化后的抗体包被酶标板,并用生物素对其标记,从人精子提取CFTR作为抗原,用辣根过氧化物酶偶联的亲和素检测,优化两种抗体浓度及实验参数,建立可定量检测CFTR蛋白的双抗体夹心BA-ELISA方法;用临床精子标本评估所建立方法的重复性、特异性等.结果:CFTR包被抗体和生物素化CFTR抗体最适浓度分别为4μg/ml和10μg/ml,最佳封闭液为1％ BSA-PBST,抗原与包被抗体最佳反应时间60 min,底物显色最佳时间15 min.批内、批间变异系数分别为2.16％ ～ 9.23％和2.29％ ～ 11.71％,包被的CFTR抗体与精子胞浆蛋白无交叉反应,最低检出下限为0.15 ng/ml,标准反应曲线具有良好的线性关系R2=0.962.结论:成功创建了定量检测CFTR蛋白的ELISA方法,具有特异性强、灵敏度高等特点.