基于XcmI识别序列的T载体的构建及连接PCR片段的优化

摘要

目的:构建基于XcmI识别序列的T载体并对与其连接的PCR片段进行优化.方法:首先将5'和3'端含有Xcm I识别序列的人组蛋白H4 cDNA定向克隆至pCDNA3.0表达载体中,再用Xcm I酶切得到基于pCDNA3.0载体骨架的T载体,为提高T载体与DNA片段的连接效率,在DNA片段PCR扩增前将其引物进行磷酸化并在PCR结束后再用Taq DNA聚合酶和dATP处理,分别将长度为312 bp和1 329bp的PCR片段T载体连接并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,培养转化子,通过菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳估算转化子的阳性率.结果:经Xcm I酶切后的T载体能高效地与目的DNA片段连接;除T载体本身质量外,扩增DNA片段所用引物的磷酸化与否也是影响克隆效率的重要因素之一;对较大的插入片段而言,经PCR扩增、纯化后再用Taq DNA聚合酶和dATP处理也能够显著增加连接效率.结论:克服了对蓝白筛选或插入自杀基因等实验条件的限制,可为T载体的常规制备并与目的片段进行高效地连接提供了新的线索.