人氨基肽酶N在猪丁型冠状病毒感染HEK293细胞中的作用

摘要

以HEK293细胞为模型,探讨人氨基肽酶N(human aminopeptidase N,hAPN)在猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)入侵人源细胞中的作用。RT-qPCR/RT-PCR鉴定PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况,再用CRISPR/Cas9技术构建敲除hAPN基因的HEK293细胞系,通过CCK-8试验验证敲除细胞和野生型细胞的细胞活性;用RT-qPCR和Western blot检测hAPN敲除和过表达对PDCoV复制的影响;进一步通过同源建模和分子对接预测PDCoV S蛋白和hAPN蛋白的结合位点。结果显示:PDCoV在感染HEK293细胞后12~36 h快速增殖,在36 h达到顶峰,在HEK293细胞上至少可传至2代;hAPN敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无明显差异,细胞敲除hAPN可显著抑制PDCoV复制,细胞过表达hAPN可促进PDCoV复制;同源建模和分子对接表明,S1蛋白可与hAPN蛋白结构域II结合,主要是S1蛋白的受体结合基序1(receptor binding motif 1,RBM1)氨基酸残基TYR^(92)、THR^(51)、THR^(48)、PHE^(16)和MET^(14)通过氢键与hAPN蛋白的氨基酸残基PHE^(490)、GLN^(531)、ARG^(528)和SER^(529)结合。hAPN在PDCoV感染人源细胞中发挥重要作用,为深入研究PDCoV的细胞入侵和跨种传播机制提供了新的理论依据。