基于GFP的锌指核酸酶真核细胞筛选体系的构建与验证

摘要

旨在构建基于GFP报告基因的ZFN真核细胞筛选体系,为ZFN的筛选提供一种直观、准确、灵敏的方法.以pEGFP N1为基础,去除EGFP基因的起始密码子后在多克隆位点上游插入ATG,构建筛选体系的通用载体pEGFP ATG.将ZFN的靶序列插入到通用载体EGFP基因上游,且使起始密码子和EGFP基因处于不同ORF中,构建筛选载体pEGFP 728.将pEGFP 728转入Hela细胞中,G418筛选Hela 728细胞系,转染ZFN到Hela 728,48 h内通过观察荧光判断ZFN是否有效,挑取荧光细胞进行PCR、测序验证靶序列的敲除.测序分析表明,通用载体pEGFP ATG和含靶序列的筛选载体pEGFP 728序列完全正确;pEGFP 728转入Hela细胞中观察不到绿色荧光,说明靶序列插入后使EGFP发生移框;转染靶序列对应的ZFN到Hela 728中,48 h观察到荧光的表达,说明ZFN有效;挑取6个荧光细胞单克隆,PCR、测序表明4个克隆靶序列发生缺失突变.锌指核酸酶真核细胞筛选体系构建成功.相对于其他方法本筛选体系更加准确、直观、灵敏,更适用于动植物等真核细胞的ZFN筛选,同时还可应用于TALEN和CAS9的筛选.