鸡囊胚细胞DMSO细管冷冻保存技术研究

摘要

旨在研究高效鸡囊胚细胞(Blastodermal cells,BCs)冷冻保存技术,为利用BCs保存禽类雌性遗传资源以及胚胎干细胞研究奠定基础.采用解冻后二乙酰荧光素(Fluorescein diacetate,FDA)染色以及培养24 h后细胞贴壁率双重检测BCs活力方法,比较二甲基亚砜(DMSO)不同浓度、不同冷冻与解冻速率等对BCs的冷冻保存效果.结果表明:(1)DMSO不同浓度,20％组解冻后活力最高(0.58),与15％组差异不显著(P＞0.05),但与5％、10％和25％组差异极显著(P＜0.01);细胞复苏后贴壁率,20％组最高(30.5％),与1 5％组差异不显著(P＞0.05),与25％组差异显著(P＜0.05),与5％和10％组差异极显著(P＜0.01).(2)冷冻速率,使用三步法冷冻,以-1℃·min-1的速率降温至-7℃,保持10 min,继续降温分别至-15、-35、-55、-75℃后,投入液氮中保存,-75℃组解冻后活力最高(0.53),但与-35℃、-55℃组差异不显著(P＞0.05);贴壁率,各组间差异极显著(P＜0.01),其中-35℃组最高(36.6％).(3)37℃水浴解冻,10 s、1 min、2 min、3 min解冻后,各组间活力差异不显著(P＞0.05),其中10 s组最高(0.60),解冻后贴壁率,37℃水浴1 min组结果最好(43.9％),与水浴2 min组差异不显著(P＞0.05),但与水浴10 s组差异显著(P＜0.05),与水浴3 min组差异极显著(P＜0.01).50℃水浴5 s、20 s、40 s、1 min解冻,5 s组活力最高(0.70),与20 s组差异显著(P＜0.05),与40 s、1 min组差异极显著(P＜0.01),解冻后贴壁率,各组间差异均极显著(P＜0.01),其中50℃水浴5 s组最高(36.9％),50℃水浴1 min组最低(5.6％).综上表明,鸡BCs使用DMSO浓度为20％的冷冻保护剂进行细管冷冻,以 1℃·min-1的速率降温至-7℃保持10min,继续以此速率降温至-35℃后,投入液氮保存,37℃水浴1～2 min解冻,BCs通过FDA染色与体外培养贴壁率双重检测均可获得较好效果.