旨在克隆奶牛核受体亚家族1 D组成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1,NR1D1)基因的蛋白编码序列(coding sequence, CDS),构建其真核表达载体,预测分析NR1D1基因的生物学功能,并检测该基因的组织表达谱及其在卵巢组织的表达分布。本研究以5头健康的24月龄雌性奶牛为试验动物,PCR扩增带有同源臂的奶牛NR1D1基因CDS区全长片段,利用同源重组法将目的片段连接至线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA空载体,构建重组质粒,利用酶切、PCR及测序对重组质粒进行鉴定。结合质粒测序结果,利用生物信息学软件预测分析该基因的生物学功能。将鉴定正确的质粒转染至HEK293T细胞,利用实时荧光定量PCR(qPCR)与Western blotting技术检测NR1D1基因在mRNA与蛋白水平的表达。此外,利用qPCR检测奶牛NR1D1基因的组织表达谱,并利用免疫组织化学技术检测NR1D1蛋白在奶牛卵巢组织的表达分布。结果,成功获得带有同源臂的奶牛NR1D1基因的CDS区全长片段(1 884 bp),酶切、PCR及测序结果表明pcDNA3.1-3HA-cNR1D1真核表达载体构建成功。生物信息学分析结果显示,NR1D1蛋白不存在跨膜结构,为核蛋白,其核定位序列存在于第200位氨基酸附近,且NR1D1蛋白中存在86个潜在的磷酸化位点;奶牛与小鼠NR1D1蛋白三级结构较为相似,奶牛NR1D1蛋白可能在奶牛生殖、代谢与免疫等生理过程中发挥重要作用。将pcDNA3.1-3HA-cNR1D1转染至HEK293T细胞,奶牛NR1D1基因在mRNA与蛋白水平均成功过表达。qPCR结果显示,NR1D1基因在奶牛瘤胃、结肠与肝中表达量显著高于其他组织;免疫组织化学结果显示,奶牛NR1D1表达于不同发育时期卵泡的颗粒细胞中。本研究成功构建了奶牛NR1D1基因真核表达载体,且在HEK293T细胞成功实现了该基因的过表达,对奶牛NR1D1基因及其编码蛋白的理化性质与生物学特性进行了预测分析,并获得了该基因的组织表达谱及在奶牛卵巢组织的表达分布情况,为深入探究奶牛NR1D1基因的生物学功能提供了前期基础与关键材料。
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