山羊NR1D1基因真核表达载体的构建及生物信息学分析

摘要

本研究旨在构建山羊核受体NR1D1基因的真核表达载体,以探究其在山羊生物钟系统中的功能。从山羊卵巢组织提取总RNA,反转录合成cDNA后通过PCR扩增山羊NR1D1基因的编码序列(Coding Sequence,CDS)。将获得的目的片段与酶切线性化的真核表达载体pcDNA3.1-Puro-N-3HA进行同源重组连接,把PCR、酶切和测序鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-g NR1D1。将pcDNA3.1-Puro-N-3HA质粒和pcDNA3.1-3HA-g NR1D1重组质粒转染至HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和Western Blotting技术检测重组质粒的过表达效果,同时对NR1D1基因进行生物信息学分析。结果显示:pcDNA3.1-3HA-g NR1D1真核表达载体构建成功,且与转染pcDNA3.1-Puro-N-3HA组相比,pcDNA3.1-3HA-g NR1D1真核表达载体转染组中NR1D1基因在mRNA和蛋白表达水平均显著升高;山羊NR1D1基因CDS区长度为1851bp,共编码616个氨基酸;山羊NR1D1蛋白为不稳定蛋白,不含跨膜结构和信号肽,且该蛋白的三级结构与人和小鼠高度相似。本研究成功构建了山羊NR1D1基因的真核表达载体,在mRNA和蛋白水平验证了其在HEK293T细胞的过表达效果,为进一步研究山羊NR1D1基因的生物学功能提供了前期基础。