人类白细胞抗原DR4(*0405)表达细胞系的建立

摘要

目的 构建人类白细胞抗原(HLA)DR4(*0405)真核表达载体,并使其在小鼠成纤维细胞系中得到稳定表达.方法 从含HLA-DRA全长cDNA的质粒中扩增HLA-DRA的开放读码框(ORF)序列,通过酶切将载体pIRES2-EGFP中的增强绿色荧光蛋白(EGFP)切除,将HLA-DRA ORF插入到载体中;采用RT-PCR方法从HLA-DR4(*0405)阳性人外周血单个核细胞中克隆出HLA-DRB1*0405 ORF序列,将其插入pIRES2-DRα载体的多克隆位点处,构建出真核表达载体pIRES2-DRαβ1*0405.对构建的载体进行限制性内切酶鉴定和测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入小鼠成纤维细胞系DAP2.3中,G418抗性筛选,并进行单克隆扩增.通过流式细胞术对细胞克隆进行鉴定,筛选出高表达HLA-DR4(*0405)的细胞株,并采用激光共聚焦显微镜观察HLA-DR4(*0405)在小鼠成纤维细胞中的表达情况.结果 酶切鉴定和测序证实目的 基因插入正确且序列与Genbank一致.流式细胞术筛选得到了高表达HLA-DR4(*0405)的稳定转染细胞株,阳性率达到74.65%.激光共聚焦显微镜观察证实HLA-DR4(*0405)分子在小鼠成纤维细胞系得到了表达,主要分布于胞膜及胞质内.结论 成功构建出真核表达载体pIRES2-DRαβ1*0405,并在小鼠成纤维细胞系中获得稳定表达,为进一步开展HLA-DRB1*0405的功能研究和转基因鼠模型的建立奠定了基础.