微小RNA-33a对平滑肌细胞表型转化的调控机制研究

摘要

目的:微小RNA-33a(miR-33a)可调控动脉粥样硬化进展,对斑块内巨噬细胞及内皮细胞影响巨大,但对平滑肌细胞的作用尚不明确.本研究旨在探究miR-33a对平滑肌细胞表型转化的调控机制.方法:培养人主动脉平滑肌细胞(HASMC),给予不同浓度(10、20、50、80、100 ng/ml)血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)处理24 h、48 h,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,根据以上结果确定最终用药浓度.测序筛选与HASMC表型转化相关的微小RNA(miRNA),挑选合适的miRNA并验证.实验分组:确定用药浓度后分对照组、PDGF-BB组(20 ng/ml PDGF-BB诱导HASMC);转染细胞48 h后又分为无义序列(NC)对照组、miRNA过表达组(miR-33a mimics)、沉默NC+诱导组(inhibitor NC+PDGF-BB诱导HASMC)、miRNA沉默+诱导组(miR-33a敲减inhibitor+PDGF-BB诱导HASMC).实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测平滑肌肌动蛋白α(ACTA2)、平滑肌22α(TAGLN)、骨桥蛋白(OPN)等,蛋白免疫印迹(Western blot)检测磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)等.采用瞬时转染技术过表达及沉默miR-33a,观察其对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达及平滑肌细胞表型转化的影响.结果:用20 ng/ml PDGF-BB处理48 h时,MTT法结果显示,HASMC增殖较明显;细胞划痕实验结果显示,HASMC迁移较明显,因此选用20 ng/ml PDGF-BB处理48 h作为后续用药条件.测序及验证结果示,miR-33a可能与HASMC表型转化相关.RT-qPCR结果显示,PDGF-BB组与对照组相比,以及miRNA过表达组与NC对照组相比,ACTA2、TAGLN表达量均明显降低,OPN表达量均明显升高.Western blot结果显示,PDGF-BB组与对照组相比,以及miRNA过表达组与NC对照组相比,ACTA2、钙调蛋白1(CNN1)及肌球蛋白重链11(MYH11)表达量均明显降低,OPN表达量均明显升高,PI3K/Akt/mTOR通路均被激活,表达量明显升高;与PDGF-BB组和miRNA过表达组相比,miRNA沉默+诱导组中ACTA2、CNN1及MYH11表达量明显升高,OPN表达量明显降低,PI3K/Akt/mTOR通路被抑制,表达量下降.结论:miR-33a介导PI3K/Akt/mTOR通路促进平滑肌细胞表型转化,加速动脉粥样硬化的发生和发展.