共表达胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶双自杀基因杀伤大鼠血管平滑肌细胞的机制研究

摘要

目的:研究共表达胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)双自杀基因对大鼠血管平滑肌细胞的杀伤机制.方法:将表达CD和(或)TK的单、双自杀基因重组腺病毒载体分为4组即Ad-EF1α-CD组、Ad-CMV-TK组、Ad-EF1o-CD-CMV-TK组和Ad-lacZ组.感染原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞,感染复数为20.给予相应的前体药物5-氟胞嘧啶和脱氧鸟苷后,用四甲基偶氮挫盐微量酶反应比色法(MTI)和流式细胞术分析细胞死亡率.荧光染料Hoechst 33342核染色观察凋亡细胞.琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞基因组脱氧核糖核酸(DNA)的降解.结果:血管平滑肌细胞可被重组腺病毒有效感染(70%).MTF检测发现Ad-EF1α-CD-CMV-TK组双自杀基因及其前体药物[5-氟胞嘧啶(30μg/ml)和脱氧鸟苷(0.3μg/ml)]的细胞毒效应可达91%,高于Ad-CMV-TK组(68%)和Ad-EF1α-CD组(63%)单自杀基因组.流式细胞仪分析Ad-CMV-TK组和Ad-EF1α-CD-CMV-TK组的杀伤作用是以细胞毒性坏死和凋亡为主.凋亡细胞荧光染色显示Ad-EF1o-CD-CMV-TK组和Ad-CMV-TK组细胞的凋亡率分别为11.0%和12.0%,高于Ad-CMV-LacZ组(1.2%)和Ad-EF1α-CD组(5.0%).琼脂糖凝胶电泳发现在Ad-CMV-TK组和Ad-EF1α-CD-CMV-TK组的基因组DNA可见到梯样条带.结论:CD/TK双自杀基因对血管平滑肌细胞的杀伤作用大于CD或TK单自杀基因;其杀伤机制是以诱导细胞的坏死和凋亡为主.