显微注射增强绿色荧光蛋白-逆转录病毒检测缺血缺氧新生大鼠皮质神经干细胞的增殖

摘要

目的用显微注射增强绿色荧光蛋白（EGFP）-逆转录病毒的方法检测缺血缺氧对新生大鼠内源性神经干细胞增殖的影响。方法新生7dSD大鼠结扎左侧颈总动脉，并给予氧浓度为8％的氧氮混合气体缺氧处理2h，制作新生大鼠缺血缺氧模型；将绿色荧光蛋白（GFP）基因片段定向插入逆转录病毒载体pLNCX2，转染DH5a感受态细胞，用lipofectamine将pLNCX2-EGFP逆转录病毒载体导入PA317包装细胞，用G418筛选获得抗性细胞克隆，扩增抗性细胞并收集病毒上清；用显微注射的方法往正常组及缺血缺氧模型动物皮质注射EGFP-逆转录病毒；取脑组织制作冰冻切片，用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染细胞核，荧光显微镜下观察缺血缺氧前后动物大脑皮质EGFP阳性细胞（内源性神经干细胞）的增殖情况。结果成功构建了EGFP-逆转录病毒，并将病毒注射到对照组及模型组动物皮质，荧光显微镜观察显示，新生鼠缺血缺氧后EGFP阳性细胞（内源性神经干细胞）的数目比正常动物多，正常组皮质GFP标记的细胞数为（104±9）；模型组皮质GFP标记的细胞数为（169±12），差异有统计学意义（P〈0．01）。结论显微注射EGFP-逆转录病毒是观察内源性神经干细胞增殖的理想方法；缺血缺氧能促进新生大鼠皮质神经干细胞的增殖。