RNA干扰ezrin基因真核生物表达载体的构建及鉴定

摘要

目的构建用于RNA干扰（RNAi）的小发夹RNAshRNA表达载体并检测其对ezrin基因的沉默效果。方法以ezrin为靶基因，以pGenesil-1质粒为载体，设计和构建重组体，根据GeneBank数据库提供的ezrin核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，设计2条小发夹结构的DNA序列，经退火形成互补双链，克隆到空载体pGenesil-1中，转化DH5a菌株，提取质粒，予以酶切和测序鉴定；重组质粒转染786-0肾癌细胞株，运用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法进行筛选鉴定。结果酶切及测序鉴定表明成功地构建重组质粒shRNA—ezrin1、shRNA—ezrin2；荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，肾癌细胞中shRNA—ezrin1、shRNA—ezrin2mRNA相对表达量分别为（0．3376±0．0166）及（0．4661±0．0266），shRNA—ezrin1与shRNA-ezrin2相对表达量差异有统计学意义（P〈0．01），根据基相对表达量算出shRNA—ezrin1，shRNA—ezrin2ezrin—mRNA的表达量抑制率分别为66．33％及53．29％。转染重组质粒后显著抑制786-0细胞中ezrinmRNA和蛋白表达，其中shRNA—ezrin1的抑制效率最高。结论成功构建ezrin基因的shRNA表达载体，并筛选出抑制率较高的重组质粒载体shRNA-ezrin1，为进一步研究ezrin基因沉默对肾癌786-0细胞株生物学行为的影响奠定基础。