细胞团块悬浮培养法对兔关节软骨细胞表型维持效果的研究

摘要

目的 探索并构建一种操作相对简便、成本较低,且能够较好维持关节软骨细胞表型的体外培养扩增体系.为建立表型稳定的关节软骨细胞库提供新思路.方法 改良式三步酶解消化法获取兔关节软骨细胞作为原代种子细胞.分别进行常规单层贴壁培养法扩增传代和细胞团块-悬浮培养并传代.流式细胞仪法对比两种培养体系软骨细胞生长动力学特点.免疫组化技术和Westercbolt法对比两种培养体系中次代软骨细胞标志性产物Ⅱ型胶原蛋白的表达情况.结果 ①兔关节软骨细胞在常规单层贴壁培养体系中扩增较快,但迅速失去圆形外观,并逐渐形成类似于纤维细胞样的长梭形外观,即发生去分化现象.免疫组化染色和Western bolt检测结果显示,Ⅱ型胶原蛋白的表达能力随着传代次数增加而递减,到P4代细胞基本不表达.②悬浮培养培养软骨细胞扩增较慢,其生长曲线近似于原代软骨细胞.各代细胞聚集成团,最大可获得直径约4mm的软骨细胞团块,单个细胞保持圆形或类圆形外观.各代细胞的Ⅱ型胶原蛋白表达水平基本稳定,并可在细胞周围形成含有Ⅱ型胶原蛋白的类似于细胞外基质样结构.结论 悬浮培养模式较为接近软骨细胞的生理条件,可获得表型较稳定的关节软骨子代细胞,并保持了Ⅱ型胶原蛋白合成和分泌能力,可能作为软骨组织工程研究的种子细胞来源之一.