可回复性永生化逆转录病毒载体phTERTGPlox的构建与表达

摘要

目的 探讨以hTERT作为永生化基因、嘌呤霉素乙酰转移酶基因puro作为筛选基因、加强型绿色荧光蛋白EGFP作为报道基因、loxP作为重组位点构建可回复性永生化逆转录病毒载体,为建立可回复性永生化细胞株奠定基础.方法 用NheⅠ酶切线性化pBABE-puro产生两个相同的黏端,与loxP双链混合连接构建成载体pBABE-puro-lox;用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切下逆转录病毒载体pBABE-hTERT-puro上约3.5kbhTERT基因片段,插入pBABE-puro-lox载体的相应酶切位点之间,重组的新载体称为phTERTPlox;扩增出无终止密码子的EGFP基因片段并插入phTERTPlox,正确构建的载体命名为phTERTGPlox.转染包装细胞PT67并用嘌呤霉素选择培养,在荧光显微镜下观察绿色荧光细胞,免疫组化染色检测hTERT基因的表达.结果 EcoRⅠ和NheⅠ双酶切鉴定phTERTGPlox形成4.0kb和5.3kb两个片段,转染PT67细胞荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光细胞,免疫组化染色结果显示稳定转染的细胞胞核呈阳性染色.结论 成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体phTERTGPlox.