干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响

摘要

试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus,PRV)复制的影响.使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系.通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3-/-单克隆稳定细胞系.为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测.结果 显示,PK15-IRF3-/-细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3-/-细胞荧光强度明显强于PK15细胞.感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3-/-病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞.在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果.进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-β mRNA会随着时间增加显著增高(P＜0.05),但PK15-IRF3-/-细胞中IFN-β mRNA则无明显变化.上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略.