Smad泛素化调节因子2siRNA的筛选及转染原代肾小管上皮细胞条件的优化

摘要

试验旨在优化Smad泛素化调节因子2(Smurf2) siRNA最佳转染条件,筛选最佳siRNA干扰片段,进而实现对Smurf2基因的瞬时沉默,为研究Smurf2基因在马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephrohathy,AAN)中的作用奠定基础.本研究通过培养小鼠原代肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs),并以脂质体LipofectamineTM 2000为转染介质,将Smurf2 siRNA转染入RTECs;通过观察绿色荧光的表达量及Real-time PCR反应优化转染条件,转染后Real-time PCR检测mRNA表达抑制率.CCK-8法检测Smurf2 siRNA复合物对RTECs活性的影响;同时,用Real-time PCR和Western blotting检测不同位点Smurf2 siRNA对Smurf2表达的影响.结果显示,当LipofectamineTM 2000与siRNA比例为1.5 μL∶30 pmol时,转染效率最高,为70％～80％;Smurf2-619 siRNA干扰效果最明显;与正常组相比,转染siRNA组的Smurf2蛋白表达水平显著下降(P＜0.05).最终确定了Smurf2 siRNA最佳转染条件,其中Smurf2-619 siRNA对Smurf2表达的抑制率最高.