藏猪CDKN1B基因克隆、生物信息学及表达分析

摘要

【目的】探究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(CDKN1B)基因在低氧适应中发挥的作用。【方法】对藏猪CDKN1B基因CDS区进行克隆并测序,并对其序列进行相似性比对及系统进化树构建。采用在线软件对CDKN1B蛋白进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测藏猪和大约克猪心脏、肾脏及肺脏组织中CDKN1B基因的mRNA和蛋白相对表达量。【结果】藏猪CDKN1B基因CDS区序列长597 bp,与野猪的相似性高达100%,且与野猪的亲缘性最近,与斑马鱼的亲缘性最远。CDKN1B蛋白由198个氨基酸组成,共有30个磷酸化位点:17个丝氨酸位点、9个苏氨酸位点、4个酪氨酸位点;氨基酸不稳定指数(Ⅱ)为66.53;该蛋白为亲水性蛋白,疏水性最大值为1.089,最小值为—2.867。藏猪CDKN1B蛋白二级结构由无规则卷曲(73.23%)、α-螺旋(15.66%)、延伸链(10.10%)及β-转角(1.01%)组成,三级结构预测结果与二级结构一致。该蛋白为非跨膜蛋白和非分泌蛋白,主要定位于细胞核中,占比约为82.6%,在细胞质中约占8.7%,在线粒体和细胞骨架中均占4.3%。CDKN1B蛋白与CDK2、CCND1和CDK4相关性高达99.9%。藏猪和大约克猪CDKN1B mRNA表达量与蛋白表达量一致,均为在心脏中表达量最高,其次是肾脏和肺脏;藏猪心脏、肾脏和肺脏组织中CDKN1B基因mRNA表达量极显著或显著高于大约克猪(P<0.01;P<0.05),蛋白表达量只在肾脏组织中显著高于大约克猪(P<0.05)。【结论】本试验成功克隆出藏猪CDKN1B基因CDS区序列,CDKN1B基因在心脏、肾脏及肺脏组织中均具有较高的表达量,且在藏猪心脏、肾脏及肺脏组织中表达量高于大约克猪。该结果为进一步研究藏猪CDKN1B基因及其编码蛋白在低氧适应性中的作用奠定基础。