定点饱和突变提高L-脯氨酸-4-羟化酶的酶活

摘要

为了提高L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(4-Hyp)的能力,首先对实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4h的P4H进行三维结构模拟和"热点"氨基酸分析,选择了7个位于"疏水口袋"附近的氨基酸残基(Y205,K207I241,F137,T142,V53和R45)进行定点饱和突变,得到P4H酶活力明显提高的突变型酶F137R和Y205K.采用F137R和Y205K催化转化0.35 g/L L-脯氨酸产物4(Hyp质量浓度分别为55.09 mg/L和52.29 mg/L),比野生型酶分别提高了58％ 和50％.经过分子对接比较发现,突变型P4 H的活性中心没有发生显著变化,酶活的提高可能是由于突变作用使蛋白构型发生了轻微改变,增加了该酶与底物或辅底物的亲和力引起的.该结果为进一步利用P4H生物合成4-Hyp提供了重要的理论基础.