分离自苏云金芽胞杆菌的首例细菌乌头酸异构酶TbrA的酶学性质研究

摘要

[目的]乌头酸异构酶(aconitate isomerase,AI)可介导具有多重生物学活性及应用潜力的小分子物质反式乌头酸(trans-aconitic acid,TAA)的合成.本文通过表征来自苏云金芽胞杆菌的生物体首条AI基因(tbrA)的产物——TbrA蛋白的催化性质,填补人们对于AI酶学特性的认识.[方法]我们利用大肠杆菌Rosetta菌株和Ni2+柱亲和纯化获得了His6-TbrA蛋白,并在体外通过HPLC检测了产物生成及对应酶活.[结果]TbrA蛋白的最适pH、温度与离子强度分别为8.0,37 °C和25 mmol/L.TbrA在10 °C时仍保留约60％的活性,展现了较好的耐低温特性.金属离子Mg2+、Ca2+与还原剂DTT可显著增强TbrA活性,而Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+则强烈抑制TbrA活性.TbrA将顺式乌头酸(cis-aconitic acid,CAA)异构为TAA 的正反应Km、Vmax,kcat、kcat/Km值分别为6.25 mmol/L、1.39 μmol/(L·s)、4.08 1/s,0.65 L/(mmol·s),将TAA异构为CAA的逆反应的上述数值分别为71.50 mmol/L、4.17 μmol/(L·s),12.25 1/s,0.17 L/(mmol·s).[结论]AI酶蛋白TbrA可以在温和的理化条件下表现出最高活性,且更倾向于合成TAA.本研究定量描述了TbrA催化特性,为其今后应用于TAA工业生物合成奠定基础.