鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因敲除及其功能特性

摘要

Ⅵ型分泌系统(T6SS)是大多数革兰氏阴性细菌中都存在的一种重要的分泌系统,能介导细菌与细菌之间以及细菌和宿主细胞之间的相互作用,溶血素共调节蛋白(Hcp)和缬氨酸甘氨酸重复蛋白G(VgrG)是组成T6SS穿刺装置的重要组分.但鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统的Hcp与VgrG在该菌入侵宿主细胞及抗吞噬过程中发挥的作用尚不十分清楚.[目的]本研究旨在利用基因敲除技术构建的鼠伤寒沙门氏菌hcp及vgrg基因缺失株体外接种真核上皮细胞和巨噬细胞,并以其亲本株作为对照,以研究Hcp及VgrG在该菌粘附、侵入上皮细胞及抗吞噬过程中所发挥的作用.[方法]通过优化Red同源重组系统操作过程中各个条件,建立一套快速敲除鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因的操作系统,成功构建鼠伤寒沙门氏菌CVCC541的hcp及vgrg单基因缺失株、双基因缺失株及三基因缺失株,并用Hela细胞接种试验和菌落计数试验,评估不同菌株的粘附和侵袭能力;用小鼠巨噬细胞RAW 264.7接种试验,评估不同菌株的抗吞噬能力.[结果]与亲本株CVCC541粘附侵袭Hela细胞相比,基因缺失株CVCC541 Avgrg、CVCC541 Ahcp2Avgrg和CVCC541Ahcp1Ahcp2Ahcp3的粘附率分别为17.17％±2.1％、14.73％±2.5％和82％士3.7％;CVCC541Avgrg、CVCC541 Δhcp2Avgrg和CVCC541Ahcpl Ahcp2Ahcp3的侵袭率分别为7.05％±1.05％、6.21％±1.35％和87％±3.25％;与亲本株CVCC541在小鼠巨噬细胞RAW 264.7中的存活相比,基因缺失株CVCC541Avgrg、CVCC541Ahcp2Avgrg和CVCC541Ahcp1Ahcp2Ahcp3的存活率分别为15.67％±2.9％、14.47％±1.87％和56.12％±3.48％.[结论]鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统VgrG和Hcp对该菌入侵细胞和抗吞噬方面具有重要作用,该研究为鼠伤寒沙门氏菌通过六型分泌系统与宿主细胞相互作用的机制研究奠定了基础.