过表达pps基因和aroGfbr基因对北京棒杆菌L-色氨酸合成的影响

摘要

[目的]通过增加北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)PD-67芳香族氨基酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的供应,解除终产物对芳香族氨基酸合成途径中第一个酶同时也是关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(DS)的反馈抑制并提高抗反馈抑制的DS的活力,使碳流更多地流向芳香族氨基酸合成途径,从而积累更多L-色氨酸.[方法]运用PCR技术扩增北京棒杆菌PD-67磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因PPs,与表达载体连接构建重组质粒pXPS;运用重叠PCR技术定点突变大肠杆菌(Escherichia coli受苯丙氨酸调控的DS基因aroG,使相应的编码氨基酸序列发生突变:Leu175Asp,新的基因命名为aroGfbr,与表达载体连接构建重组质粒pXA;构建pps和aroGfbr的共表达重组质粒pXAPS.将3个重组质粒分别转入菌株PD-67,构建工程菌株PD-67/pXPS、PD-67/pXA和PD-67/pXAPS.通过摇瓶发酵研究工程菌株的发酵特性.[结果]酶活分析结果表明,pps基因和aroGfbr基因在北京棒杆菌PD-67中均实现了表达.工程菌株PD-67/pXA粗酶液DS抗反馈抑制分析表明,AroGfbr已解除酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制.过表达pps基因和aroCfbr基因分别使工程菌L-色氨酸产量提高12.1％和26.8％,双基因共表达可使工程菌的产酸量提高35.9％.[结论]北京棒杆菌PD-67pps基因的过表达以及大肠杆菌来源的解除反馈抑制的aroGfbr的过表达均有助于增加PD-67 L-色氨酸的合成,而双基因的共表达可以进一步提高L-色氨酸的积累量.