过表达

摘要： 背景:作者所在课题组前期通过高通量测序结果发现长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1在盆腔器官脱垂患者子宫主韧带中表达明显降低,转化生长因子β1信号通路也是相关通路之一。目的:观察长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1对盆底韧带成纤维细胞的影响,探讨其在盆腔器官脱垂疾病发病机制中的可能作用。方法:提取大鼠盆底韧带组织标本,分离成纤维细胞,进行原代培养。慢病毒构建长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1干扰和过表达载体加入成纤维细胞中。通过免疫荧光、MTT、细胞划痕实验、流式细胞术来检测成纤维细胞的形态、增殖、迁移和凋亡情况;RT-PCR和Western-blot检测转化生长因子β1、smad2/3、c-Myc的mRNA及蛋白表达情况。结果与结论:①长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1过表达时可显著促进成纤维细胞的增殖,提高细胞的迁移能力,抑制成纤维细胞凋亡;长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1干扰时结果相反;②此外,长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1过表达时细胞中的c-Myc、转化生长因子β1、smad2/3的mRNA和蛋白相对表达量均明显增加,其干扰时则显著抑制c-Myc和转化生长因子β1的表达;③提示长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1能够影响成纤维细胞的形态和生物学功能,可能与转化生长因子β1/smad2/3/c-Myc通路有关;该研究可为盆腔器官脱垂患者的临床诊断和治疗提供新思路。

摘要： 目的构建人P4型磷脂转移酶11A或11B(ATP11A或ATP11B)表达载体,并检测其上调ATP11A或ATP11B的效果。方法根据ATP11A或ATP11B序列设计引物,克隆到克隆载体(EZ-T^(TM)Cloning Vector)上,通过酶切鉴定,并经测序验证。分别将ATP11A和ATP11B序列酶切、定向连接到表达载体pLVX-IRES-mCherry、pLVX-IRES-RFP上。然后利用脂质体将重组带有免疫荧光蛋白的表达质粒转染至HEK-293T,最后通过测序、荧光显微镜检、流式细胞测量术分析、免疫印迹对重组细胞株进行表达验证。结果通过电泳及酶切鉴定证实了ATP11A、ATP11B表达载体的成功构建,荧光显微镜定性观察质粒转染效率,流式细胞测量术检测转染效率分别为38.9%、41.9%,免疫印迹法只检测到转染表达质粒的细胞有标签蛋白而对照组均无蛋白表达。结论成功构建了人ATP11A、ATP11B的表达载体,并可有效上调其表达水平,为将来应用ATP11A或ATP11B进行机制研究奠定了基础。

摘要： 本研究首先克隆鹅FOXO3基因编码区(CDS)序列,构建FOXO3基因的真核表达载体,然后将其转染至鹅卵泡颗粒细胞中,利用荧光定量PCR方法检测FOXO3基因对细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达水平的影响。结果显示,本研究成功克隆了鹅FOXO3基因CDS序列,并由此构建了真核表达载体pcDNA3.1-FOXO3。鹅卵泡颗粒细胞FOXO3基因过表达实验发现,过表达组凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Fasl的mRNA表达水平较对照组均升高(P<0.05),而自噬相关基因LC3和Beclin1的mRNA表达水平较对照组均降低(P<0.05)。本研究结果表明,FOXO3基因可能影响鹅卵泡颗粒细胞中凋亡及自噬相关基因的表达,进而调控颗粒细胞的凋亡和自噬。

摘要： 旨在鉴定非编码RNA circNMT1,明确其组织和细胞的表达模式,以及探究过表达circNMT1对脂肪细胞分化的影响。本试验以30月龄中国沼泽水牛(信阳水牛,n=3)的心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、背部皮下脂肪组织和前体脂肪细胞以及3T3-L1细胞为试验材料。通过半定量PCR和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术对circNMT1进行鉴定、细胞定位并明确其时空表达模式。进一步分别将其过表达到3T3-L1和水牛前体脂肪细胞中,利用形态学方法及定量方法检测过表达后脂滴累积情况,同时采用qRT-PCR检测脂肪标志基因相对表达水平的变化。结果表明,circNMT1是真实存在且稳定表达的circRNA,在水牛前体脂肪细胞的细胞核和细胞质中均表达,且在脂肪组织和成熟的脂肪细胞中高表达(P<0.001)。功能获得性试验表明,在3T3-L1细胞和水牛脂肪细胞,circNMT1显著促进脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高成脂标志基因PPARG、C/EBPα和FABP4的相对表达水平(P<0.01)。circNMT1可能是水牛脂肪细胞分化的正调控因子,这为circNMT1在水牛脂肪细胞中的调节作用提供了新见解。

摘要： 目的:通过基因干扰和过表达技术,研究V-ATP酶H亚基(V-ATPase membrane subunit H,VMAH)蛋白在柑橘绿霉病菌指状青霉生长中的生理功能,及其作为抗柑橘绿霉病药物作用靶点的可行性。方法:采用菌丝生长法和孢子萌发法,研究沉默和过表达VMAH基因对正常和胁迫条件下指状青霉细胞生长特性的影响。结果:在正常生长条件下,沉默VMAH基因显著抑制了指状青霉菌丝体的生长;而过表达VMAH基因对菌体生长表现出显著促进作用。在不同pH值环境下,沉默VMAH基因显著抑制了指状青霉菌丝的生长,尤其在偏酸性(pH值低于2)和偏碱性(pH值高于8)条件下尤为显著;而过表达VMAH基因在一定程度上促进了菌体菌丝的生长,pH值为6时,其促进作用最显著。与野生株相比,沉默VMAH基因对胞外Ca^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+)等金属离子胁迫处理较为敏感。VMAH基因沉默菌株对质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性显著增加,尤其V-ATP酶专一性抑制剂巴佛洛霉素A_(1)最为明显;而VMAH基因过表达菌株对质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性显著降低。结论:VMAH在指状青霉生长过程中发挥重要作用,是研发低耐药性柑橘采后杀菌剂的潜在作用靶点。

摘要： 目的构建稳定过表达硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)的HEK293细胞株,为TrxR1的功能研究以及靶向TrxR1药物筛选提供细胞模型。方法通过PCR扩增,连接转化以及Sanger双脱氧测序构建并筛选出TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1,转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株。后续研究分为3组进行:①TrxR1过表达HEK293细胞:pLVX-Puro-TXNRD1载体稳定转染细胞;②对照HEK293细胞:pLVX-Puro空载病毒载体稳定转染细胞;③正常HEK293细胞;通过RT-qPCR、Western blot实验检测上述3组细胞中TrxR1的mRNA以及蛋白表达情况;通过胰岛素终点法以及TRFS-green探针成像检测上述3种细胞内TrxR1的酶活力;通过CCK8实验检测上述3种细胞对TrxR1特异性抑制剂auranofin的敏感性。结果构建载体经DNA测序,成功获得插入TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1。与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1的mRNA和蛋白高表达,且酶活力也同样显著上升(P<0.005);而与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,auranofin对HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1酶活力以及细胞增殖的抑制效率均显著下降(P<0.005)。结论通过构建pLVX-Puro-TXNRD1慢病毒载体,成功获得过表达TrxR1酶的HEK293细胞株,该细胞对特异性靶向TrxR1的抑制剂的抗增殖作用具有抵抗,因而可用于靶向TrxR1药物的筛选。

摘要： 本研究旨在探究DKK2基因过表达后在敖汉细毛羊成纤维细胞中的表达量变化。采集40日龄敖汉细毛羊胎羊皮肤组织作为实验样品,首先参照GenBank中绵羊的DKK2基因序列信息进行引物设计,通过PCR反应对DKK2基因进行扩增,并与pGM-T载体进行连接反应,构建了pGM-T-DKK2重组质粒;将克隆载体转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,进行目的片段的克隆;鉴定正确后构建pcDNA3.1-DKK2重组质粒;并将pcDNA3.1-DKK2重组质粒转染敖汉细毛羊成纤维细胞,检测过表达载体对成纤维细胞DKK2基因的表达水平变化。酶切、测序鉴定结果显示,成功构建了pcDNA3.1-DKK2过表达载体,并且转染敖汉细毛羊成纤维细胞后DKK2基因实验组的表达量极显著高于对照组;Western Blot实验结果显示,实验组的蛋白表达水平极显著高于对照组。本实验成功构建了pcDNA3.1-DKK2过表达载体,并成功转染了敖汉细毛羊成纤维细胞,为进一步研究DKK2基因的功能奠定了基础。

摘要： NF-YA是组成NF-Y转录因子的3个亚基之一,在植物中参与生长发育、胁迫响应以及与微生物互作等重要生物过程。通过克隆BnNF-YA1,并对BnNF-YA1进行生物信息学分析和表达模式分析,分离克隆其编码序列,构建过表达载体,转化甘蓝型油菜,通过阳性鉴定获得BnNF-YA1的转基因阳性植株,并对过表达BnNF-YA1的转基因植株进行了逆境表型鉴定。结果表明,BnNF-YA1的开放读码框为858 bp,编码285个氨基酸;烟草瞬时表达分析发现BnNF-YA1蛋白定位于细胞核内;酵母生化分析表明BnNF-YA1全长蛋白没有转录激活活性;表达分析结果显示,BnNF-YA1受PEG处理诱导表达,且在幼叶、花苞和受精后20 d的角果中表达水平较高;过表达BnNF-YA1的甘蓝型油菜对PEG和MV处理的耐受性提高,表明BnNF-YA1可能参与调控甘蓝型油菜对渗透胁迫和氧化胁迫的响应。

摘要： 核黄素又名维生素B_(2),是人体必不可少的营养物质之一,而鸟苷三磷酸则是核黄素合成的重要前体。为在高产菌株的基础上进一步提高核黄素产量,该研究以高产核黄素的枯草芽孢杆菌S1为出发菌株,利用CRISPER/Cas9介导的基因组碱基编辑技术对嘌呤合成途径阻遏蛋白基因以及鸟嘌呤核苷酸(guanylate,GMP)还原酶基因进行失活,并利用质粒过表达的方法进行了一系列的代谢工程改造。结果显示,guaC基因的失活阻断了GMP到肌苷酸的回补途径,使GMP得到积累,使核黄素产量达到3.04 g/L,而purR基因的失活没有效果;使用PvegI启动子过表达希瓦氏菌来源的ribA后,核黄素产量提高到3.33 g/L。将失活guaC基因与PvegI启动子过表达希瓦氏菌ribA结合,最终使核黄素产量达到3.43 g/L,较出发菌株核黄素产量提升22%,转化率提升25.8%。

摘要： 目的探究驱动蛋白家族成员2A(kinesin super family protein 2A,KIF2A)过表达与食管鳞癌的增殖和预后的相关性。驱动蛋白家族成员2A是驱动蛋白-13超家族蛋白的一员,且KIF2A在许多肿瘤的发展中发挥着重要作用。然而,KIF2A在食道鳞状细胞癌(esophageal cell squamous carcinoma,ESCC)中的作用仍不清楚。方法使用己方收集的样本通过免疫组化来研究对比KIF2A在ESCC和正常组织中的表达水平和预后情况。通过细胞实验和动物实验研究KIF2A在ESCC中的机制。结果免疫组化显示,KIF2A在ESCC组织中相对高表达,并与该病预后相关。集落形成实验、细胞增值实验与细胞毒性实验(CCK-8)和蛋白质印迹(western blotting)结果显示,KIF2A的敲低可以明显降低ESCC细胞的形成能力和增殖能力。动物实验结果表明,敲低KIF2A可以明显减少小鼠的肿瘤体积。结论KIF2A可以作为ESCC的预后因素之一,而敲低KIF2A可以分别抑制ESCC在体外和体内的增殖。KIF2A可以作为未来ESCC的潜在预后生物标志物和治疗靶点。

摘要： microRNA是一类参与转录后调控的小核糖核酸分子，mRNA通过与靶基因结合在很多生命过程中起到重要的调控作用。microRNA的成熟需要Drosha、Dicer等多种酶的先后作用，从细胞质进入细胞核，最终由约为70个碱基的茎环结构前体剪切加工成为成熟的micmRNA并发挥作用。miR-15/16/195/424/497是一个具有广泛调控作用的microRNA家族，涉及免疫，凋亡，肿瘤发生，肌肉生长和细胞周期调控等多诸多方面。本实验以构建小鼠miR-195的过表达载体为基础，研究不同长度原始转录本对小鼠miR-195过表达效果的影响，以期为进一步探讨miR-195在细胞和个体水平的调控作用奠定基础。

摘要： 本发明公开了一种植物花器官优势表达基因

摘要： 本发明涉及一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法及其应用，表达载体、表达系统及其制备方法，属于基因工程技术领域。本发明中的方法应用CHO细胞内源miRNAs与3′‑UTR转录区互补结合来对筛选标记基因表达进行负性调节，进而提高目的基因的表达量。将miRNAs与3′‑UTR转录区克隆到筛选标记基因的下游，构建真核表达载体；然后将目的基因克隆到真核表达载体获得重组表达载体，然后将其转染细胞，获得CHO细胞表达系统，实现目的基因的高效表达。本发明的CHO细胞表达系统，可以显著提高目的基因在CHO细胞中的表达水平，实现目的蛋白在CHO细胞的高产量稳定表达。

摘要： 本发明公开了一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法。所述方法包括：1)表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种的构建；2)采用摇瓶发酵或者发酵罐进行诱导培养；3)蛋白纯化。本发明提供了一种新的sST2重组蛋白表达和纯化方法，通过酵母表达系统表达sST2重组蛋白，利用发酵罐技术提高产量，并且证明酵母源sST2具有良好的生物学活性，稳定性良好，应用验证显示其可以作为sST2化学发光检测试剂盒校准品。此外，本发明还建立了一种全新的表达量检测方法，完成了诊断试剂盒的应用验证，解决了目前sST2规模化生产方面的多个难点，能够满足诊断试剂领域对sST2需求，为sST2规模化生产提供新思路。

摘要： 提供作为副作用的细胞毒性少且MEX3B基因的表达抑制能力提高的核酸、含有上述核酸的MEX3B基因表达抑制剂、抑制MEX3B基因表达的方法及起因于MEX3B基因表达的疾病的预防或治疗剂。核酸为下述(1)～(3)中的任一者：(1)由序列表的序列号1或2中记载的碱基序列组成的寡核苷酸；(2)由在序列表的序列号1或2中记载的碱基序列中缺失、取代及/或添加1个或2个碱基而得的碱基序列组成、且抑制MEX3B基因的表达的反义寡核苷酸；(3)包含序列表的序列号3中记载的碱基序列、且抑制MEX3B基因的表达的反义寡核苷酸。

摘要： 本发明提供作为副作用的细胞毒性低且能够抑制MEX3B基因的表达的核酸、包含上述核酸的MEX3B基因表达抑制试剂、抑制MEX3B基因表达的方法及由MEX3B基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂。抑制MEX3B基因的表达的核酸，所述核酸为：反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有与MEX3B基因的外显子中的非翻译区中的包含至少10个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列；或者双链RNA或编码上述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含上述非翻译区中的至少20个连续核苷酸。

摘要： 一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白C3及其表达载体、表达菌株、表达方法和应用，涉及基因工程、合成生物学领域；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明剔除已知序列人Ⅲ型胶原蛋白中的非CTHR区，优选CTHR区与保留的N‑端和C‑端的非螺旋区编辑重组而成的加强版微型人胶原蛋白，其核心功能区序列与人胶原蛋白对应部分100％相同，应用于人体中不会造成免疫排斥反应。其稳定性高，同时具有高拉伸强度、生物降解性能、亲水性较好与促进细胞生长、促进细胞粘附、促进胶原密度增加、与新生细胞和组织协同修复创伤等特性，在化妆品、医疗和食品领域极具应用前景。该菌株有效、稳定，制备方法简单，可在低成本下获得较高产量，易于工业化。

摘要： 本发明属于重组蛋白表达技术领域，具体涉及人源化细胞瞬时表达载体、表达系统及其应用。本发明构建的表达载体，引入TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件，并且TAP作为独立表达框，相比未引入该元件的表达载体，能够成倍提高目的蛋白瞬时表达量；更进一步的，本发明将TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件与核基质结合区元件MAR和IRES复配使用，相互之间协同增效，进一步提高目的蛋白的瞬时表达量。由此，本发明提供的表达载体和表达系统能够应用于制备蛋白类药物。

摘要： 本发明公开了一种牙鲆SOCS3基因及其真核表达载体、表达系统和异源表达方法。所述牙鲆SOCS3基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示。扩增所述牙鲆SOCS3基因的上游引物如SEQIDNO.2所示，下游引物如SEQIDNO.3所示。本申请在成功克隆牙鲆SOCS3基因的基础上，进一步构建了牙鲆SOCS3基因的真核表达载体pEGFP‑C1‑PoSOCS3，并将其成功转染HEK293T细胞中，荧光倒置显微镜观察牙鲆SOCS3基因在细胞中的亚细胞定位，为后续的牙鲆SOCS3功能研究提供了基础资料。

摘要： 本发明涉及一种使用源自乳杆菌的两种启动子能够在微生物表面上共表达两种不同的靶蛋白的载体和使用该载体在微生物表面上表达靶蛋白的方法。将包含插入其中的外源基因的载体转化到微生物中，并使不同的外源蛋白在该微生物的表面上稳定地表达。此外，本发明涉及一种包含编码聚‑γ‑谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA的表面表达载体以及使用该载体在微生物表面上表达靶蛋白的方法。将包含插入其中的外源基因的载体转化到微生物中，并使外源蛋白在该微生物的表面上稳定地表达。

摘要： 本发明公开了一种植物花器官优势表达基因JAZ‑10、其表达产物、表达载体及应用，旨在促进当前雄性不育、种子败育植物品种的构建或筛选等技术的深入发展。本发明鉴定出一个可调控植物生殖器官发育的基因JAZ‑10，构建了其过表达载体和CRISPR/Cas9载体，并分别转化获得对应过表达株系和基因敲除植株；经花器官的显微观察表明，JAZ‑10能够调控植物子房心皮、雄蕊和柱头毛的发育，其在分子育种、杂交育种、杂种优势、种子败育植物品种的构建或筛选等方面具有重要的应用价值。