环糊精葡萄糖基转移酶的酿酒酵母表面展示及其生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸

摘要

[目的]将环状芽孢杆菌251(Bacillus circulans 251)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glycosyltransferase,CGTase)展示在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞表面,构建全细胞催化剂生产2-0-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G),以提高AA-2G的产量.[方法]将CGTase编码基因cgt连接到载体质粒pYD1中的a凝集素(a-agglutinin) Aga2p亚基基因的下游构建表面展示重组质粒pYD1-cgt,转化酿酒酵母EBY100获得重组菌EBY100-pYD1-cgt,对发酵条件(培养基、诱导温度和诱导剂半乳糖浓度)进行优化;同时先后对重组菌的发酵产酶以及表面展示CGTase的酶促合成AA-2G的条件进行了优化;进一步又比较了表面展示的CGTase与E.coli BL21发酵所得的游离CGTase在酶促制备AA-2G过程中副产物的积累情况.[结果]展示CGTase的酿酒酵母重组菌株以YPG培养基作为发酵培养基,诱导剂半乳糖初始添加浓度为20 g/L,经25℃诱导48 h后,表面展示CGTase最大酶产量为0.5 U/mL;表面展示CGTase 40℃条件下的温度稳定性比游离酶有所提高,pH稳定范围变宽.对表面展示的CGTase制备AA-2G转化条件的优化发现,其最适温度最适pH分别为30℃和4.5,转化48 h达到平衡,表面展示的CGTase制备AA-2G的产量较游离酶提高了37％.[结论]对于CGTase,a凝集素系统是一个有效的展示系统,构建的酿酒酵母全细胞催化剂用于酶促制备AA-2G时,产生的副产物葡萄糖可能被酵母细胞利用,从而降低了葡萄糖与VC的竞争作用使AA-2G的产量增加,该全细胞催化剂具有良好的应用前景.