根癌农杆菌化学受体MCP1912调节趋化响应功能的鉴定

摘要

【目的】本研究以根癌农杆菌C58为材料，鉴定其甲基趋化受体蛋白（methyl-accepting chemotaxis protein,MCP） MCP1912能够识别的配体，并研究该蛋白在调控根癌农杆菌趋化响应中的具体功能。【方法】通过异源表达MCP1912的配体结合结构域（ligand binding domain,LBD），获得带有His标签的LBD蛋白(LBD1912)。利用基于荧光的热位移测定法（fluorescence-based thermal shift assay,TSA）筛选出LBD1912的潜在配体；通过等温滴定量热（isothermal titration calorimetry,ITC），进一步确定筛选出的潜在配体，并测定LBD1912与配体结合之后的解离平衡常数KD。利用基于同源重组的精准DNA片段删除方法，敲除根癌农杆菌C58中编码MCP1912的基因atu1912，获得MCP1 912缺失突变体(ΔMCP1912)；以质粒回补的方法，获得ΔMCP1912回补株(ΔMCP1912C)。利用毛细管趋化测定法，测定根癌农杆菌及其突变体对筛选出来的MCP1912潜在配体的趋化响应，并最终确定MCP1912在调控根癌农杆菌C58趋化响应中的具体功能。【结果】通过TSA，筛选出5种能引起LBD1912的熔解温度（Tm）变化大于2°C的潜在配体（大于2°C意味着可能结合），这5种潜在配体是丙酮酸、L-乳酸、丙酸、乙酸和乙醇酸。ITC实验进一步确定，只有丙酮酸和丙酸能与LBD1912特异性结合。丙酮酸与LBD1912的结合是放热过程，KD为（17.0±0.9）μmol/L，而丙酸与LBD1912的结合是吸热过程，KD为（31.5±5.4）μmol/L。毛细管趋化试验证实，根癌农杆菌C58能够被丙酮酸吸引和躲避丙酸，MCP1912的缺失，完全消除了根癌农杆菌对这两种物质的趋化响应，MCP1912的回补能够恢复其对这两种物质的趋化响应。【结论】化学受体MCP1912识别的配体是丙酸和丙酮酸，MCP1912介导C58对于丙酮酸的吸引趋化响应以及躲避丙酸的趋化响应。