基于细胞热漂移测定(CETSA)技术鉴定活细胞内药物靶标的标准操作流程

摘要

【目的】细胞热漂移测定(cell thermal shift assay, CETSA)技术是一种检测细胞内药物(配体)和蛋白质(靶标)相互作用的技术,原理是当蛋白质结合药物后,其热稳定性会发生变化,通过测定这种变化去鉴定药物和蛋白之间的相互作用。本研究以治疗多发性骨髓瘤的靶向药帕比司他(panobinostat)为例,建立基于蛋白印迹杂交(Western blotting)和CETSA技术的药物靶蛋白鉴定的标准操作流程。【方法】首先用药物panobinostat处理培养的K562细胞,然后加热处理细胞、裂解细胞及提取可溶性蛋白,以及用抗靶蛋白的抗体经Western blotting定量可溶性蛋白。【结果】经Western blotting定量及曲线拟合,成功得到3个蛋白——组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC1)、人突触蛋白(humansyntaxin-4,STX4)以及四三肽重复结构域(tetratricopeptiderepeat domain38,TTC38)随温度变化的热熔解曲线和恒定温度条件下的药物剂量反应曲线。【结论】HDAC1、STX4及TTC38为药物panobinostat在K562细胞中的靶蛋白。本研究建立了基于CETSA和Western blotting技术,鉴定活细胞中药物靶标蛋白的标准操作流程。实验可在2–3 d内完成。