家蚕微孢子虫海藻糖酶3的表达、定位及功能

摘要

[目的]本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索.[方法]通过PCR扩增Nb Tre3,构建原核表达载体pET28a-NbTre3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia coli中表达重组蛋白NbTre3,Western blot检测目的蛋白;Ni柱亲和层析法对重组蛋白NbTre3进行纯化,用获得的NbTre3免疫新西兰兔制备多克隆抗体;利用间接免疫荧光技术对成熟家蚕微孢子虫中的NbTre3进行定位;qRT-PCR检测家蚕微孢子虫感染家蚕5龄起蚕后不同时间中肠中Nb Tre3的转录水平;通过分别注射siRNA-1,siRNA-2和siRNA-3进行RNAi,qRT-PCR检测RNAi后不同时间感染家蚕微孢子虫的家蚕5龄起蚕中肠中Nb Tre3和16S rRNA的转录水平.[结果]成功纯化并获得重组目的蛋白NbTre3,大小约为34 kD.免疫新西兰兔后,收集血清,纯化获得NbTre3多克隆抗体,经Western blot鉴定正确.间接免疫荧光结果显示NbTre3主要分布在成熟家蚕微孢子虫孢原质中.qRT-PCR结果表明,家蚕微孢子虫感染后6h时家蚕5龄起蚕中肠中Nb Tre3的表达量最高;siRNA抑制Nb Tre3的表达后,家蚕微孢子虫16S rRNA的转录水平没有明显的变化.[结论]结果提示NbTre3可能在家蚕微孢子虫感染初期的发芽过程中发挥重要的作用.