Bmo-miR-375-3p对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L表达的调控作用

摘要

[目的]探究家蚕Bombyx mori miRNAs对丝素蛋白轻链基因(fibroin light chain gene,BmFib-L)和P25蛋白基因BmP25表达的调控作用.[方法]分别以BmFib-L和BmP25 mRNA 3'UTR为靶序列,应用在线预测软件RNAhybrid从前期家蚕4和5龄幼虫后部丝腺(posterior silk gland) sRNA高通量测序获得的29个差异表达bmo-miRNAs中,筛选对BmFib-L和BmP25具有调控作用的候选bmo-miRNAs;采用半定量RT-PCR方法在mRNA水平分析候选bmo-miRNAs及其靶基因BmFib-L和BmP25在4和5龄幼虫期以及5龄第3天幼虫不同组织的表达水平;利用双荧光报告基因检测系统在家蚕细胞BmN中验证候选bmo-miRNAs对BmFib-L和BmP25表达的调控作用.[结果]筛选到一个在BmFib-L和BmP25 mRNA 3'UTR上都有靶位点的bmo-miR-375-3p(曾称bmo-miR-375*).在后部丝腺中bmo-miR-375-3p和其预测靶基因BmFib-L和BmP25都有较高的表达水平,提示bmo-miR-375-3p具备调控BmFib-L和BmP25表达的时空条件.miR-375-3p重组表达载体与融合了BmFib-L 3'UTR的萤火虫荧光素酶(luciferase)报告基因(luc)表达载体共转染BmN细胞,报告基因luc的表达水平显著下降;而在miR-375-3p重组表达载体与融合了BmP25 3'UTR的luc表达载体共转染BmN细胞中报告基因luc的表达水平下降不显著.[结论]miR-375-3p显著下调BmFib-L基因的表达,而对BmP25基因的表达无明显调控作用.