人维甲酸受体RAR α基因在大肠杆菌中的表达

摘要

@@ 采用T7RNA启动子将RAR α cDNA定向亚克隆至PT7-7质粒,构建了重组维甲酸受体RAR α表达质粒PT7-RAR α并在大肠杆菌中得到稳定表达. 方法(1)载体构建:将PT7-7,RAR α分别用EcoR I酶切后,电泳回收1.9 kbRARα并与PT7-7相连接,酶切筛选出正向连接子(PT7-7-RAR α+);用Bal I酶切PT7-7～RAR α(MSC I为同裂酶),在其两端加上Nde I连接子;纯化后用Nde I酶切并使其自连接.(2)DNA序列分析:用PE公司生产的DyeTerminater TM测序试剂盒,以T7启动子通用引物对RAR α插入片段进行核苷酸序列分析.(3)重组RAR α受体的表达及提取:将PT7-RAR α K38(含PGP1-2)菌株,在含50μg/ml氨苄青霉素及50μg/ml卡那霉素的SR培养基中30℃培养12 h后收集菌体,细菌经超声破膜、离心,收集上清置-20℃备用.(4)Western印迹分析含受体表达载体的K 38大肠杆菌提取物,经15%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳分析,然后用RARα单克隆抗体进行Western印迹分析.(5)人重组维甲酸受体配体结合活性测定:用竞争性结合方法测定其受体结合活性,并进行Scatchard分析.