异种移植转基因用含粘附分子-2启动子的人CD59 重组基因的构建

摘要

目的构建含人粘附分子-2(ICAM-2)启动子的人补体调节蛋白CD59重组基因,并将其用于异种器官移植转基因.方法利用PCR方法从人血基因组扩增得到ICAM-2启动子、CD59基因的第一内含子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶、单酶切这两条片段,纯化回收备用;双酶切pcDNA3-CD59真核表达载体,经电泳分离、切胶回收纯化得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作为载体序列;ICAM-2启动子片段先与载体进行定向克隆连接反应后转化细菌,阳性转化菌质粒抽提及酶切鉴定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59质粒;再单酶切此质粒,纯化该载体与CD59第一内含子片段连接,转化细菌、抽提质粒,用脂质体将该质粒转染猪血管内皮细胞,流式细胞仪检测CD59蛋白表达.结果得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59质粒,以EcoR Ⅰ消化此重组质粒,产生5.5及0.5kb两片段;以HindⅢ消化重组质粒,得到5.45及0.55kb两片段,以Kpn Ⅰ/HindⅢ双酶切质粒时,出现5.0、0.55、0.4kb3条片段,对插入子分别进行测序,上述结果完全符合设计要求及正确序列.流式细胞仪检测重组基因表达阳性.结论含人ICAM-2启动子的CD59重组基因表达载体获得成功,该重组基因构建成功为转基因应用奠定了基础.