第一部分：HSP90AB1在肺癌组织中的表达和外周血蛋白水平的研究及其临床意义；第二部分：肺腺癌组织样本肿瘤驱动基因目标测序及分析研究

摘要

本文从以下几部分进行了论述：
　　第一部分:HSP90AB1在肺癌组织中的表达和外周血蛋白水平的研究及其临床意义.
　　目的:
　　HSP90AB1(Heat shock protein90kDa alpha, class B member1)是ATP依赖的高度保守的分子伴侣，在多种肿瘤细胞中过表达。在肿瘤发生发展的信号传导通路中起着重要作用的一些分子，如EGFR(epidermal growth factor receptor)、HER2(human epidermal growth factor receptor-2)等，均是HSP90AB1的底物蛋白。HSP90AB1与这些底物蛋白相互作用并参与细胞的多种病理生理过程。本研究通过检测HSP90AB1在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组织中的蛋白表达情况以及初步探讨其临床意义。
　　方法:
　　采用qPCR和Western-blot方法检测62例肺癌及癌旁组织中的HSP90AB1mRNA和蛋白表达情况。采用组织微阵列和免疫组织化学染色的方法检测HSP90AB1在213例非小细胞肺癌及相应癌旁正常肺组织中的蛋白表达，并分析HSP90AB1的表达与非小细胞肺癌临床病理参数及患者预后的关系。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测1162例肺癌（包括鳞癌371例;腺癌705例;小细胞肺癌80例）患者及282例正常健康人血浆中HSP90AB1蛋白水平，并分析肺癌及正常健康人血浆中HSP90AB1水平差异和HSP90AB1的水平与肺癌临床参数及患者预后的关系。
　　结果:
　　qPCR和Western-blot结果显示HSP90AB1 mRNA和蛋白在肺癌组织中的表达水平显著高于在癌旁组织中的表达(P＜0.05)。免疫组化结果显示HSP90AB1在肺癌组织中的表达水平（阳性率54.0％）显著高于在正常肺组织中的表达水平（阳性率0.0％，P＜0.001）。HSP90AB1在肺腺癌中的表达阳性率为61.2％，显著高于肺鳞癌组织37.9％(P=0.002)，并且其高表达与肺腺癌患者的不良预后显著相关(P=0.032)。HSP90AB1蛋白表达水平与临床分期、淋巴结转移、病理分级等因素无相关性（P＞0.05）。
　　酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示肺癌病人血浆中的HSP90AB1的水平显著高于正常健康人群(P＜0.001)。小细胞肺癌血浆中的HSP90AB1的水平显著高于非小细胞肺癌(P＜0.001)。Kaplan-Meier单因素生存分析显示肺癌外周血中的HSP90AB1和CEA（Carcino-embryonic antigen，癌胚抗原）、CA125(Cancerantigen125，癌抗原125)、cyfra211（cytokeratin19 fragments，细胞角蛋白19片段）高水平与肺癌患者的不良预后显著相关(P＜0.01)。多因素Cox回归分析也显示肺癌患者外周血中HSP90AB1高水平与患者的不良预后相关(P＜0.05)，并且HSP90AB1能够作为影响肺癌患者预后的独立因素。肺癌血浆中HSP90AB1蛋白水平与临床分期、淋巴结转移、病理分级等因素无相关性(P＞0.05)。并且肺癌患者血浆中的HSP90AB1可作为诊断早期肺癌的辅助标志物，ROC曲线下面积(AUC)为0.888（95％CI=0.864-0.909，P＜0.001），cutoff值为63.68ng/ml，灵敏度为87.8％，特异性为76.6％。
　　结论:
　　HSP90AB1在肺癌组织中高表达，并且其表达水平与肺癌的病理类型及肺腺癌患者总生存期相关。肺癌患者血浆中的HSP90AB1蛋白水平比正常人群显著升高，并且与肺癌患者的不良预后显著相关。肺癌患者外周血中的HSP90AB1、CEA、CA125、cyfra211的蛋白水平可用于判断肺癌预后。
　　第二部分:肺腺癌组织样本肿瘤驱动基因目标测序及分析研究
　　目的:
　　肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤，其中肺腺癌是肺癌中最常见的类型。随着基因分析技术的不断发展，对肿瘤的发病机制以及治疗的研究越来越深入。本研究通过对40例肺腺癌及癌旁组织DNA样品进行目标区域的483个基因测序，探讨肺腺癌组织中突变基因并研究其临床意义。
　　方法:
　　收集肺腺癌及癌旁组织手术切除的标本，首先制备基因组DNA，并进行质控。基于Illumina HiSeq2500测序平台，构建小片段文库，利用诺易康产品(AgilentsureselectXT Custom0.5-2.9Mb kit，包含483个肿瘤相关目标基因的探针)进行高覆盖率的目标区域捕获，利用双末端测序(Paired-End)的方法进行双末端测序(测序方式PE125)，获得40例肿瘤样品的测序数据。将测序结果进行生物信息学分析，在肺腺癌和配对癌旁组织中寻找发生体细胞突变基因。
　　结果:
　　测序数据的分析结果显示在40对肺腺癌及癌旁组织DNA测序样品中，有31对样本在目标区域内能够筛选到可靠的外显子突变，突变位点合计142个（涉及102个基因）。142个突变位点中位于目标捕获区域的突变位点数目为116个，所占比例为81.69％。具有这些突变位点的突变频率较高的基因有13个，分别是TP53、EGFR、PIK3CA、ATN1、ATXN1、ABL1、ALK、EGF、EPHA3、 KRAS、MAP2K3、PIK3CG、PTPRD。碱基突变中，C∶A/G∶T所占比例最高。有吸烟史且年龄较高的病人，碱基突变、基因突变比例明显较高。随后我们对其中64个基因的所包含的突变位点使用Sanger测序进行验证，验证率为98.4％。
　　结论:
　　这些数据为进一步确定肺腺癌发病分子机制和分子分型提供依据。TP53、EGFR、PIK3CA在肺腺癌病人中突变频率最高。

目录

图表索引

英文缩略词

摘要

第一部分：HSP90AB1在肺癌组织中的表达和外周血蛋白水平的研究及其临床意义

第一章 导论(含文献综述)

1 HSP90的结构和功能

2 HSP90与肿瘤

3 HSP90的抑制剂

4 总结

5 本研究的基本策略和方案

第二章 实验材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

第三章 实验结果

1 qPCR实验检测HSP90AB1在肺癌组织中的表达

2 Western-blot实验检测HSP90AB1在肺癌组织中的表达

3 免疫组化实验检测HSP90AB1在肺癌及癌旁组织中的表达

4 ELISA实验检测HSP90AB1在肺癌血浆中的蛋白水平

第四章 讨论

1 HSP90AB1蛋白在恶性肿瘤进展中的作用

2 HSP90AB1影响恶性肿瘤患者的预后

3 HSP90AB1与肺癌标志物联合作用

4 HSP90抑制剂

小结

第二部分：肺腺癌组织样本肿瘤驱动基因目标测序及分析研究

第一章 导论(含文献综述)

1 肺癌的治疗现状

2 精准医学

3 肺癌靶向治疗的现状

4 总结

5 本研究的目的和方案

第二章 实验材料方法

1 实验材料

2 实验方法

第三章 实验结果

1 肿瘤驱动基因目标测序检测肺腺癌组织中外显子突变情况

2 肺腺癌组织中目标区域基因突变的情况

3 Sanger法测序验证突变位点

第四章 讨论

小结

参考文献

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