大鼠全肝缺血再灌注后肝肾及线粒体损伤的机制和防护

摘要

背景和目的：
　　 肝脏缺血再灌注损伤为肝脏外科常见的病理生理过程。特别是90年代后，随着肝移植例数的逐年增加，供肝短缺的矛盾日益严重，移植界开始关注从无心跳供者(NHBD)获取供肝，对肝移植过程中的缺血再灌注损伤的研究日趋重视，从而广泛开展了对全肝缺血再灌注损伤的研究。肝脏的缺血及再灌注过程，势必给其它脏器带来损伤，肝缺血及门静脉瘀血可产生大量有害炎症介质，包括酸性代谢产物、内毒素、氧自由基、肿瘤坏死因子和其它炎症介质。这些有害炎症介质在肝血流恢复后立即倾注入肺，造成急性肺损伤和呼吸衰竭，流经肾脏组织，造成肾功能不全。门脉血流阻断后可使门脉压力增加，引起胃肠道毛细血管高压性受损，微循环障碍，消化道粘膜水肿、出血、坏死，形成内毒素血症及肠道细菌移位，给全身脏器带来威胁。肾脏是人体一个重要的代谢器官，其功能下降严重影响病人手术后的生存率，给移植成功带来了巨大的困难。本实验通过手术方法建立大鼠全肝缺血再灌注的创伤模型，观察再灌注损伤中炎性反应、脂质过氧化反应，H2S/CSE体系、CaN信号转导通路的变化，以寻找有效的干预措施。
　　 方法：本实验通过手术方法建立大鼠全肝缺血再灌注的创伤模型。第一部分缺血再灌注实验分组：雄性Wistar大鼠88只，随机分为11组，每组8只：
　　 1.正常对照组；
　　 2.全肝缺血20min组，再灌注2h、6h、12h、24h、48h、72h组；
　　 即20min、20min+2h、20min+6h、20min+12h、20min+24h、20min+48h、20min+72h。
　　 3.全肝缺血40min组，再灌注6h、72h组；
　　 即40min、40min+6h、40min+72h。
　　 第一部分药物干预实验分组：雄性Wistar大鼠96只，随机分为12组，每组8只；
　　 1.FK506空白对照组：假手术后给予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)。
　　 螺内酯空白对照组：螺内酯每天灌胃(20mg/kg)持续6天后假手术。
　　 甲泼尼龙(MP)空白对照组：假手术后立即给予腹腔注射MP(30mg/kg)。
　　 NaHS空白对照组：假手术后立即给予腹腔注射NaHS(28ymol/kg)。
　　 2.缺血20min再灌6h药物干预组：
　　 20min+6h+FK506组：再通后腹腔注射FK506，再灌注后6h处死。
　　 20min+6h+螺内酯组：螺内酯每天灌胃，6天后手术。
　　 20min+6h+MP组：再通后给予腹腔注射MP，再灌注后6h处死。
　　 20min+6h+NaHS组：再通后给予腹腔注射NaHS，再灌注后6h处死。
　　 3.缺血40min再灌6h药物干预组：
　　 40min+6h+螺内酯组：螺内酯术前6天每天灌胃，再灌注后6h处死。
　　 40min+6h+MP组：再通后立即给予腹腔注射MP，再灌后6h处死。
　　 4.缺血40min再灌72h药物干预组：
　　 40min+72h+螺内酯组：螺内酯术前6天每天灌胃，再灌后72h处死。
　　 40min+72h+MP组：再通后立即给予腹腔注射MP，再灌后72h处死。
　　 第二部分线粒体损伤及干预实验分组：雄性Wistar大鼠80只，随机分为10组，每组8只：
　　 正常对照组、20min+6h、药物干预及药物空白组。
　　 本实验通过手术方法建立大鼠全肝缺血再灌注的创伤模型，动态检测血浆H2S、丙二醛(MDA)、血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)、醛固酮(aldosterone，ALD)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、丁酰胆碱酯酶(BuChE)、谷丙转氨酶(ALT)、胱抑素C(CysC)的变化，检测肝脏及肾脏CSE活性，细胞间粘附分子(ICAM—1)、核因子NF-κB含量，肾损伤分子-1(KIM-1)含量，钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)含量，同时光镜HE染色下观察其二者的病理变化及线粒体呼吸功能、膜电位及线粒体ATP酶的变化。应用H2S供体NaHS、CaN抑制剂FK506及醛固酮拮抗剂螺内酯和甲泼尼龙进行干预，观察上述指标变化，进一步研究H2S、CaN及醛固酮在全肝缺血再灌注损伤中的信号传导机制及各信号通路之间的相互作用，同时研究NaHS、CaN抑制剂FK506及醛固酮受体拮抗剂螺内酯和甲泼尼龙对肝肾的干预作用。
　　 结果：
　　 第一部分结果：与正常对照组比较，血清ALT、血清CysC、血清TNF-α、血清MDA、血浆Ang II水平、肾脏KIM-1水平、肝脏ICAM-1、NF-κB水平在缺血及再灌注后开始升高，再灌注6h达到峰值。血浆BuChE缺血及再灌注后逐渐降低，于再灌注24h时降到最低值，于再灌注72h恢复到正常水平。血浆ALD、肾脏ICAM-1、NF-κB在全肝缺血20min增高并达到高峰，再灌注后开始降低。肝脏ALD同样在缺血20min后开始升高，但不同于血浆ALD，于再灌注2h达到峰值。血清H2S在缺血20min时降低，于再灌注2h恢复正常水平，然后随再灌注时间逐渐升高，6h达到峰值，随后逐渐降低，于再灌注12h再次恢复到基线水平。肝肾CSE酶活性在缺血20min显著降低，再灌注后各组CSE酶活性均较缺血20min组升高。肝肾CaN在缺血20min时开始降低降低，且随再灌注时间逐渐降低，分别于12h和6h达到最低值。FK506、螺内酯、MP、NaHS干预均使血清TNF-α、MDA、肾脏KIM-1、肝肾ICAM-1、NF-κB水平降低；螺内酯干预使血浆Ang II降低，血浆ALD升高；FK506、螺内酯、NaHS和MP使CaN含量降低；NaHS干预提高血清H2S和组织CSE酶活性；MP干预降低血清ALT水平，提高血浆BuChE含量。
　　 第二部分结果：于正常对照组比较，缺血再灌注后，肝肾线粒体ATP酶活性改变，RCR、P/O、膜电位均降低，药物干预后，各项指标均有不同程度的改善。
　　 结论：
　　 全肝缺血再灌注后可造成肝脏本身和肾脏的损伤，于再灌注6h损伤最为严重。炎性反应，脂质过氧化反应，CaN信号通路及内源性血清H2S/CSE酶体系参与了全肝缺血再灌注损伤。FK506、螺内酯、MP、NaHS可以通过降低炎细胞浸润及炎性细胞因子激活，清除氧自由基，调节H2S、CaN信号通路等途径发挥其脏器防护功能。