同种异基因骨髓移植后α-GalCer的应用加速免疫重建并未加重aGVHD

摘要

目的：造血干细胞移植后免疫重建及急性移植物抗宿主病(acutegraft-versus-host disease，aGVHD)的研究为本领域研究的热点。NKT细胞是T淋巴细胞中的一新型的调节型细胞，α-GalCer(α-galactosylceramide，α-半乳糖神经酰胺)，能特异性识别并激活NKT细胞，迅速的大量的分泌IFN-γ及IL-4。本研究在小鼠同种异基因骨髓移植模型中探讨移植后受鼠体内α-GalCer的应用是否有促进免疫重建的作用，同时不加重aGVHD，并对其机制进行初步的探讨。
　　 方法：1.建立同种异基因清髓性骨髓移植模型。C57BL/6小鼠为供鼠，BALB/c小鼠为受鼠。首先摸索出最小的清髓性辐射剂量，之后以此辐射剂量作为骨髓移植前的预处理，建立两个aGVHD严重程度不同的骨髓移植模型。2.利用aGVHD相对较轻的骨髓移植模型，实验组骨髓移植后立即腹腔注射α-GalCer，对照组骨髓移植后立即腹腔注射溶剂DMSO。移植后同一时间点检测两组小鼠脾脏的单个核细胞计数、CD3+、CD4+、CD8+、B220+、CD40+、CD86+、CD11c+、CD80+细胞的相对数目；供者细胞嵌合率；胸腺的单个核细胞计数和细胞组份；造血重建。并进行体外造血干细胞集落的培养及体内、外T、B细胞的增殖实验。3.利用aGVHD严重程度不同的两个骨髓移植模型，实验组骨髓移植后立即腹腔注射α-GalCer，对照组骨髓移植后立即腹腔注射溶剂DMSO。在每个移植模型中观察两组小鼠的生存期、aGVHD的临床表现和病理改变、供者细胞嵌合率。并进行移植后6小时血清及移植后d27脾脏单个核细胞培养上清细胞因子的检测；体内、外胸腺、脾脏、外周血、外周淋巴结单个核细胞及T细胞的迁移检测。
　　 结果：1.≥7.5Gy TBI为清髓剂量。以7.5Gy TBI为预处理，在输注相同的骨髓细胞数的前提下，输注脾细胞数3×107及1×107，建立两个aGVHD严重程度不同的同种异基因骨髓移植模型。2.在输注脾细胞数1×107骨髓移植模型中，骨髓移植后d70，实验组小鼠脾脏单个核细胞计数、CD3+、CD4+、CD8+、B220+、CD40+及CD86+细胞的比例均明显高于对照组，CD11c+、CD80+细胞的比例两组间无区别；胸腺单个核细胞计数、CD3+、CD4+、CD8+细胞的比例两组间无区别，且均较正常小鼠明显偏低。移植后早期d7，实验组供者细胞嵌合率高于对照组。移植后d3，实验组外周血白细胞高于对照组。体外造血干细胞集落培养，α-GalCer组较DMSO组CFU数目明显多。体内、外T、B细胞增殖实验，α—GalCer组较DMSO组T、B细胞明显增殖。3.在aGVHD严重程度不同的两个骨髓移植模型中，实验组小鼠较对照组小鼠生存时间明显延长，aGVHD临床表现及病理改变减轻。4.在输注脾细胞数1×107移植模型中，移植后6小时血清中IL-4水平实验组小鼠与腹腔注射α-GalCer的正常小鼠、腹腔注射α-GalCer的单纯照射小鼠无差异，均明显高于腹腔注射DMSO的单纯照射小鼠；血清中IFN-γ水平实验组小鼠与腹腔注射α-GalCer的单纯照射小鼠无差异，稍高于腹腔注射DMSO的单纯照射小鼠，均明显低于腹腔注射α-GalCer的正常小鼠。移植后d27脾脏单个核细胞培养上清中IL-4、IL-10水平实验组高于对照组，而IFN-γ、IL-2水平实验组低于对照组。5.体内、外迁移实验：在α-GalCer的作用下单个核细胞、CD3+、CD4+、CD8+细胞从胸腺、脾脏、外周血中出来，迁移至外周淋巴结。
　　 结论：1.BALB/c小鼠接受60Coγ射线TBI的致死剂量是≥7.5Gy。在接受7.5Gy TBI的预处理后，输注相同的骨髓细胞数的前提下，输注不同的脾细胞数建立两个aGVHD严重程度不同的骨髓移植模型，随着输注脾细胞数增加，aGVHD的严重程度随之增加。2.移植后α-GalCer的应用促进T细胞、B细胞的免疫重建，同时增加第二刺激信号CD86、CD40的表达。3.α-GalCer加速的免疫重建与α-GalCer促进供者细胞的早期植入、促进造血干细胞的增殖与分化、促进T、B细胞的增殖作用有关，而与改善胸腺的功能无关。4.移植后α-GalCer的应用减轻了aGVHD，而且并未以延迟植入为代价，同时维持植入的持久。减轻aGVHD的机制之一：α-GalCer使受者的NKT细胞分泌大量的IL-4，促使供者的T细胞向Th2分化；减轻aGVHD的机制之二：α-GalCer促使T淋巴细胞从胸腺、脾脏、外周血出来，迁移至外周淋巴结，减少进入至靶器官的淋巴细胞数量，从而减轻淋巴细胞对靶器官的损伤。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分 同种异基因清髓性骨髓移植模型的建立

前言

材料及方法

结果

讨论

结论

第二部分 同种异基因骨髓移植后α-GalCer的应用促进造血和免疫重建及机制探索

前言

材料及方法

结果

讨论

结论

第三部分 同种异基因骨髓移植后α-GalCer的应用减轻aGVHD及机制探索

前言

材料及方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文总结

综述 NKT细胞研究进展

本研究的主要创新点

攻读学位期间发表文章情况

致谢