内质网应激在高迁移率族蛋白B1诱导树突状细胞成熟分化中的作用

摘要

目的：内质网（ER）是真核细胞中非常重要的细胞器，非常敏感，各种应激刺激均可导致内质网功能失调，即内质网应激（ERS）。ERS持续时间及应激水平对于应激细胞的功能与生存均具有重要影响，与多种人类疾病关系密切。我们前期实验结果表明，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对树突状细胞（DC）成熟分化具有重要免疫调节作用。本实验拟对ERS是否参与HMGB1对DC免疫调节机制进行探讨，旨在从新的角度认识ERS在HMGB1介导DC免疫功能障碍中的地位与调节机制，为探索严重烧伤后脓毒症的免疫调控途径提供新思路。
　　 方法：采用雄性BALB/c小鼠分离培养脾脏DC，以含10％胎牛血清RPMI-1640调整细胞浓度1-2×106/ml，5％CO237℃培养过夜后随机分组进行如下实验：1.给予HMGB1（0.1-10μg/ml）或衣霉素（TM，ERS特异性诱导剂，0.1-10μg/ml）刺激24-72 h后，应用real time-PCR技术及Western blot分析检测ERS相关的关键分子（GRP78、SEPS1及XBP-1）表达及活化水平的改变。2.给予TM（0.1-10μg/ml）刺激24-72 h后，流式细胞术检测DC表面标志物及共刺激分子的表达情况；应用ELISA和real time-PCR技术检测TNF-α、IL-12的分泌水平。另外，采用MTT试剂盒检测其对T淋巴细胞增殖活性的影响。3.通过RNA干扰技术诱导DC中ERS关键调节分子XBP-1基因沉默后，给予HMGB1刺激（1 μg/ml，48 h），采用Western blot分析、流式细胞术、ELISA、real time-PCR等技术方法检测抑制ERS反应对HMGB1调节DC成熟分化效应的影响。4.给予TM刺激（1 μg/ml，48 h）正常DC，或HMGB1（1 μg/ml，48 h）刺激XBP-1基因沉默型DC后，流式细胞术检测DC表面晚期糖基化终末产物受体（RAGE）表达水平。
　　 结果： 1.ERS在HMGB1诱导DC成熟分化过程中具有重要作用。HMGB1刺激可明显诱导DC中ERS反应的发生，与正常对照组相比，0.1μg/ml、1μg/ml、10 μg/ml的HMGB1作用24～72h后，DC中ERS相关分子GRP78基因及蛋白水平均明显升高，XBP-1表达及活化水平亦有显著上调，其中尤以l μg/ml HMGB1刺激24 h作用效果显著（P<0.05）。但与ERS特异性诱导剂TM作用不同的是，除0.1 μg/ml HMGB1作用48 h诱导SEPS1的蛋白表达水平升高外（P<0.05），本实验所观察的其他刺激浓度和作用时间未能引起SEPS1表达的明显上调。2.TM诱导药物性ERS反应对DC功能状态有一定的影响。0.1μg/ml、1 μg/ml、10μg/ml的TM作用24～72h可导致TNF-α、IL-12的分泌增加（P<0.05），但DC表面共刺激分子表达改变不尽一致，CD80表达在0.1 μg/ml TM刺激48 h、MHC-Ⅱ表达在0.1μg/ml和1μg/ml TM刺激24-48 h可见明显增强，而CD86在本实验观察的TM各刺激浓度和时间点无显著升高。与HMGB1预孵育DC增强T淋巴细胞增殖反应不同，TM预孵育的DC对T细胞增殖活性具有明显抑制效应（P<0.05）。3.小鼠脾脏DC经XBP-1基因沉默后给予HMGB1刺激（1μg/ml，48 h），与非基因沉默细胞（未转染或转染无效序列）相比，其表面标志物及共刺激分子表达上调均明显受抑，对T淋巴细胞增殖反应及Th1功能极化的促进作用亦明显降低（P<0.05）。4.与非基因沉默细胞（未转染或转染无效序列）相比，XBP-1基因沉默阻抑HMGB1诱导的DC表面RAGE受体表达的上调（P<0.05）。TM诱导的药物性ERS反应对DC表面受体RAGE表达具有明显的上调作用（P<0.05）。
　　 结论：HMGB1刺激可诱导小鼠脾脏DC发生明显的ERS反应，应用RNA干扰技术抑制ERS反应中关键分子XBP-1的活化可阻抑HMGB1介导的DC成熟分化和表面受体RAGE的表达上调。TM诱导的ERS反应与HMGB1所致ERS反应呈现一定的差异，TM刺激可增加DC细胞因子TNF-α及IL-12的分泌，但对其表型的成熟无明显的诱导效应，TM预孵育DC对T淋巴细胞的增殖反应呈抑制作用。ERS在HMGB1诱导的DC成熟分化中具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

ABBREVIATIONS

INTRODUCTION

PART Ⅰ HMGB1 Induced ERS in Mouse Splenic DCs

Materials and Methods

Results

Summary

PART Ⅱ Effect of Pharmacological ERS Induced by TM on DCs Maturation and Function

Materials and Methods

Results

Summary

PART Ⅲ Immune Modulation and Tolerance Induced by XBP-1-Silenced DCs Through RNA Interference

Materials and Methods

Results

Summary

PART Ⅳ The Influence of ERS on the Expression of RAGE on Surface of Mouse Splenic DCs

Materials and Methods

Results

Summary

DISCUSSION

CONCLUSIONS

REFERENCES

内质网应激与急性损伤后免疫反应

参考文献

炎症复合体与炎症反应

参考文献

ARTICLE LIST

ACKNOWLEDGEMENTS