SOCS3基因沉默调控树突状细胞分化成熟在白念珠菌感染中的作用及免疫学机制初探

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述: 第一部分 siRNA介导的树突状细胞SOCS3基因沉默及沉默效率验证 目的:构建小鼠骨髓来源树突状细胞体外扩增培养方法，并制备siRNA介导的SOCS3基因沉默树突状细胞。 方法:(1)采用Lutz法在rmGM-CSF和rmIL-4共同刺激下从小鼠骨髓前体细胞诱导培养小鼠BMDC，并从形态学、细胞表面分子两方面对诱导培养的BMDC进行鉴定。(2)设计并合成了3条靶向SOCS3基因的siRNA干扰序列，定向克隆到慢病毒表达载体GV248，经脂质体转染法转染BMDC，收集转染后48h的各组DC细胞，通过Western blot及qRT-PCR分别在蛋白及基因水平验证其沉默效率，筛选沉默效率最佳的siRNA干扰序列。(3)通过AnnexinⅤ-FITC荧光标记法和台盼蓝染色法检测siRNA转染对DC细胞活性的影响。 结果:(1)体外诱导培养第8天即获得大量BMDC，倒置显微镜下观察细胞形态，大部分细胞悬浮离散，可见树枝状突起，具有DC的典型形态学特征。采用流式细胞术对诱导培养第8天DC表面分子情况进行检测，发现其高表达CD11c(＞90％)，纯度满足下一步实验要求，低表达MHCⅡ、CD40、CD86，处于未成熟状态。(2)转染后48h,siRNA#1Transfected DC、siRNA#2Transfected DC、siRNA#3Transfected DC组SOCS3在mRNA和蛋白表达水平均较空白对照组显著下降，其中siRNA#2在mRNA和蛋白水平的沉默效率均最佳(83.4％、82.7％)，被用于后续试验。(3)control DC组、non-target siRNA treated DC组、siSOCS3treated DC组细胞凋亡率均＜4％，台盼蓝染色显示三组DC细胞活性差异无统计学意义。 结论:通过体外诱导培养小鼠骨髓前体细胞的方法成功获得了足量高纯度的未成熟DC，siRNA SOCS3在基因和蛋白水平有效沉默了DC中SOCS3基因。 第二部分 SOCS3基因沉默对树突状细胞抗白念珠菌感染的生物学特性和功能的影响 目的:探讨SOCS3基因沉默对树突状细胞在白念珠菌感染中的生物学特性和功能的影响。 方法:(1)激光共聚焦扫描显微镜观察DC对白念珠菌的吞噬现象，流式细胞仪检测SOCS3基因沉默前后各组DC在不同时间点对白念珠菌的吞噬率;(2)通过计数DC与白念珠菌共培养上清液的菌落形成单位比较SOCS3基因沉默前后DC对白念珠菌的杀伤作用;(3)流式细胞仪检测白念珠菌刺激前后各组DC表面分子MHCⅡ、CD40、CD86表达情况;(4)通过Transwell迁移实验和检测DC表面趋化因子受体CCR7表达水平比较白念珠菌刺激前后各组DC迁移能力。 结果:(1)吞噬功能:siSOCS3DC组发生吞噬白念珠菌现象的DC细胞数目明显多于control DC组，且siSCOS3DC组单个细胞内吞噬的白念珠菌孢子数量明显多于control DC组，说明SOCS3基因沉默促进了DC对白念珠菌的吞噬作用;随着培养时间的延长，DC对白念珠菌的吞噬作用逐渐增强，至共培养60min时，DC对白念珠菌的吞噬能力达顶峰，75min开始下降。(2)杀伤功能:siSOCS3DC组对白念珠菌的杀伤率高于control DC组和non-target siRNA DC组，说明SOCS3基因沉默增强了DC对白念珠菌的杀伤作用。(3)细胞表面分子:经白念珠菌刺激成熟后，siSOCS3DC组细胞表面分子MHCⅡ、CD40、CD86表达水平高于control DC组，说明SOCS3基因沉默有效促进了白念珠菌诱导的DC表型成熟。(4)迁移功能:经白念珠菌刺激成熟后，siSOCS3DC组细胞迁移率以及CCR7表达水平均高于control DC组、non-target siRNA DC组，说明SOCS3基因沉默有效增强了白念珠菌诱导成熟的DC的细胞迁移功能。 结论:SOCS3基因沉默促进了DC对白念珠菌的吞噬、杀伤功能，DC经白念珠菌刺激后具备了更成熟的细胞表型，并获得了更强的细胞迁移功能，提示SOCS3基因沉默增强了DC在白念珠菌感染过程中的免疫原性。 第三部分 SOCS3基因沉默DC通过IL-6/STAT3通路增强Th17抗白念珠菌保护性免疫应答 目的:探讨SOCS3基因沉默DC对初始T淋巴细胞增殖分化方向的影响。 方法:(1)通过ELISA、qRT-PCR、Western Blot检测各组DC中细胞因子IL-6、IL-12的表达水平。(2)通过Western blot检测各组DC中STAT3磷酸化水平。(3)免疫磁珠法分离小鼠脾脏T淋巴细胞，通过混合T淋巴细胞实验检测各组DC刺激T淋巴细胞增殖的能力。(4)将各组DC与小鼠脾脏T淋巴细胞共培养，通过胞内因子染色法检测IFN-γ+CD4+T淋巴细胞(Tb1)、IL-4+CD4+T淋巴细胞(Th2)、IL-17+CD4+T淋巴细胞(Th17)占CD4+T淋巴细胞的百分比，通过qRT-PCR检测Th1、Th2、Th17细胞转录因子T-bet、GATA3、RORγt mRNA表达水平。(5)加入外源性抗IL-6中和抗体，通过Western Blot检测共培养体系中RORγt、IL-17A、IL-23R的蛋白表达水平。 结果:(1)经白念珠菌刺激成熟后，siS0CS3DC组IL-6在蛋白及基因表达水平均明显高于control DC组、non-target siRNA DC组，但IL-12p35的基因表达水平和IL-12p70的蛋白表达水平在三组间的差异均无统计学意义。(2)经白念珠刺激成熟后，各组DC中STAT3的磷酸化水平均较相应未予白念珠菌刺激的对照组升高，其中siS(OCS3DC组STAT3的磷酸化水平较control DC组、non-target siRNAD)C组升高更明显。(3)在与白念珠菌共培养后，各组DC诱导CD4+T淋巴细胞增殖的能力均较相应未予白念珠菌刺激的对照组增强;当DC:T淋巴细胞比例为1∶200及1∶50时，siSOCS3DC组诱导CD4+T淋巴细胞增殖的能力较control DC组及non-target siRNA DC组更明显。(4)经白念珠菌刺激成熟后，各组DC与T淋巴细胞共培养体系中，IFN-γ+CD4+T淋巴细胞(Th1)、IL-4+CD4+T淋巴细胞(Th2)、IL-17+CD4+T淋巴细胞(Th17)占CD4+T淋巴细胞的百分比均较相应未予白念珠菌刺激组升高，siSOCS3DC组IL-17+CD4+T淋巴细胞占CD4+T淋巴细胞的百分比高于control DC组、non-target siRNA DC组，但IFN-γ+CD4+T淋巴细胞及IL-4+CD4+T淋巴细胞占CD4+T淋巴细胞的百分比在三组间无统计学差异。(5)经白念珠菌刺激成熟后，各组DC与T淋巴细胞共培养体系中，T-bet、GATA3、RORγt mRNA水平均较相应未予白念珠菌刺激的对照组升高，siSOCS3DC组RORγt mRNA水平高于control DC组和non-target siRNA DC组，但T-bet、GATA3mRNA水平在三组间无统计学差异。(6)外源性IL-6中和抗体处理的siSOCS3DC经白念珠菌刺激成熟后与T淋巴细胞共培养，其RORγt、IL-17A、IL-23R的蛋白表达水平较siSOCS3DC+C.albicans组下降，但仍高于control DC+C.albicans组。 结论:在白念珠菌感染过程中，SOCS3基因沉默DC通过活化IL-6/STAT3信号转导通路诱导CD4+T淋巴细胞向Th17方向分化。

目录

常用英文缩略语

摘要

前言

参考文献

第一部分 siRNA介导的树突状细胞SOCS3基因沉默及其沉默效率验证

一、实验材料

1．1实验主要仪器与设备

1．2主要实验试剂

1．3实验相关试剂的配制

1．4实验动物

二、实验方法

2．2流式细胞仪检测DC表面Mite Ⅱ、CD40、CD86、CD11c表达情况

2．3靶向SOCS3 siRNA重组慢病毒表达载体的构建及转染

2．4 qRT-PCR检测SOCS3 mRNA表达水平

2．5 Western blot检测SOCS3蛋白表达水平

2．6 Annexin V-FITC／PI双染法

2．7台盼蓝染色

2．8统计学处理

三、实验结果

3．2筛选沉默效率最佳siRVA干扰序列

3．3 siRNA转染对DC活性的影响

四、讨论

参考文献

第二部分 SOCS3基因沉默对树突状细胞抗白念珠菌感染的生物学特性和功能的影响

一、实验材料

1．1实验仪器与设备

1．2主要实验试剂

1．3实验相关试剂的配制

1．4实验菌株及细胞

二、实验方法

2．1．激光共聚焦显微镜观察DC对白念珠菌的吞噬现象

2．2．流式细胞仪检测DC对白念珠菌的吞噬作用

2．3．DC对白念珠菌的杀伤作用

2．5．Transwell细胞迁移实验

2．6．流式细胞仪检测DC表面趋化因子受体CCR7

2．7．统计学处理

三、实验结果

3．1．SOCS3基因沉默对DC吞噬白念珠菌功能的影响

3．2．SOCS3基因沉默对DC杀伤白念珠菌功能的影响

3．3．SOTS3基因沉默对DC表型成熟的影响

3．4．SOCS3基因沉默对DC迁移能力的影响

四、讨论

参考文献

第三部分SOCS3基因沉默DC活化IL-6／STAT3通路增强Th17抗白念珠菌感染保护性免疫应答

一、实验材料

1．1．实验仪器与设备

1．2．主要实验试剂

1．3．主要实验试剂的配制

1．4．实验菌株与细胞(同第二部分)

2．2．qRT-PCR检测检测IL-6、IL-12p35 mRNA表达水平

2．3．Western blot检测IL-6、IL-12p35、STAT3、pSTAT3蛋白水平

2．4．混合淋巴细胞反应(CFSE标记法)

2．5．胞内因子染色法

2．6．qRT-PCR检测转录因子T-bet、RORγt、GATA3表达情况

2．7． Western blot检测ROR γt、IL-17A、IL-23R蛋白水平

2．8．数据的统计分析

三、实验结果

3．1． SOCS3基因沉默促进白念珠菌诱导成熟DC分泌IL-6，并促进STAT3磷酸化

3．2． SOCS3基因沉默增强白念珠菌诱导成熟DC刺激CD4+T淋巴细胞增殖的能力

3．3． SOCS3基因沉默促进白念珠茵刺激成熟DC诱导Th17细胞免疫应答

3．4． 外源性抗IL-6部分阻断SOCS3基因沉默DC对Th17细胞极化的诱导作用

四、讨论

参考文献

全文小结

综述 SOCS3在感染性疾病中的研究进展

研究生阶段发表论文

致谢

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