核因子-κB在胰岛素抵抗和糖尿病大鼠中的表达及格列喹酮对其表达水平的影响

摘要

第一部分实验性胰岛素抵抗大鼠模型的建立。
　　 目的：使用高脂饮食诱导胰岛素抵抗(IR)大鼠模型，为进一步实验研究做准备。
　　 方法：将60只2月龄雄性Wistar大鼠随机分为青年正常对照组(A组)、青年胰岛素抵抗组(B组)，中老年正常对照组(C组)及中老年胰岛素抵抗组(D组)，每组15只，正常对照组(A、C组)给予普通饮食喂养，胰岛素抵抗组(B、D组)使用高脂饮食喂养，监测大鼠体重变化。喂养2个月后，测定血胆固醇、甘油三酯等指标，同时对各组大鼠行高胰岛素正葡萄糖钳夹实验。比较各组间基础血糖、血脂、血胰岛素水平的差异。计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、葡萄糖输注速率(GIR)等指标。
　　 结果：大鼠体重随着年龄的增加而增加，IR组较同年龄大鼠体重增加较为为明显(p<0.05)。与正常对照组相比，I组大鼠血胰岛素水平显著升高，HOMA-IR显著升高，GIR水平显著下降，提示IR大鼠模型造模成功。14月龄组大鼠(C、D组)HOMA-IR值高于相应4月龄组大鼠(A、B组)(P<0.05)，14月龄对照组大鼠HOMA-IR及葡萄糖钳夹结果均明显高于4月龄对照组，显示出胰岛素抵抗的特征。
　　 结论：高脂喂养方法可以建立稳定的IR大鼠模型，此模型可用于胰岛素抵抗疾病状态的研究；随着大鼠年龄的增长，胰岛素抵抗指数及GIR水平显著升高。研究结果提示高脂饮食、年龄增加等均是胰岛素抵抗发生的独立危险因素。
　　 第二部分NF-κB及T游炎症因子在胰岛素抵抗大鼠肾脏、心肌中的表达。
　　 目的：1.探讨胰岛素抵抗大鼠肾脏组织中NF-κB及环氧合酶(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等表达的变化及意义。2.探讨胰岛素抵抗大鼠心肌组织中NF-κB及单核趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等表达的变化及意义。
　　 方法：健康雄性Wistar大鼠30只从2月龄开始饲养，随机分为正常对照组、胰岛素抵抗组(每组15只)。以高脂高糖喂养法构造胰岛素抵抗大鼠模型，并使用高胰岛素正葡萄糖钳夹实验验证模型的有效性。留取大鼠肾脏、心脏等组织。观察各组大鼠肾脏、心肌结构的变化(HE)，免疫组化染色观察肾脏组织中NF-κB、iNOS和COX-2等蛋白表达情况；观察心肌细胞中NF-κB、MCP-1和ICAM-1等蛋白表达情况。实时定量逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)检测肾脏组织中NF-κB、iNOS和COX-2mRNA表达情况；检测心脏组织中NF-κB、ICAM-1和MCP-1mRNA表达情况。采用凝胶电泳迁移率(EMSA)法测定各组大鼠肾脏组织NF-κB的DNA结合活性。
　　 结果：1.对胰岛素抵抗模型进行正葡萄糖钳夹实验，IR组GIR水平较对照组明显降低，提示造模成功。2.对照组肾小球及小管间质未见异常病理改变；胰岛素抵抗模型组可见大鼠肾小球体积增大、系膜区增宽等肾脏组织早期受损表现。与对照组相比，胰岛素抵抗组心肌HE检查结果显示病理改变并不明显。3.免疫组化染色：对照组见极少数肾小球细胞核表达NF-κB，而胰岛素抵抗组NF-κB在肾小球细胞核中呈高水平表达。胰岛素抵抗组肾小球细胞胞浆中COX-2和iNOS阳性表达亦显著增加，平均吸光度值与对照组相比差异有显著性意义(p<0.05)；胰岛素抵抗组心肌组织中NF-κB、ICAM-1和MCP-1表达水平均较对照组明显升高，平均吸光度值与对照组相比差异有显著性意义(p<0.05)。4.RT-PCR:NF-κBmRNA水平在胰岛素抵抗组明显升高，相应的下游炎症因子的表达水平在胰岛素抵抗组中亦升高明显。5.EMSA:与对照组相比，胰岛素抵抗组肾脏组织NF-κB结合活性显著增加(p<0.05)。
　　 结论：胰岛素抵抗大鼠肾脏、心脏等组织中存在NF-κB的激活，从而启动下游靶基因MCP-1、ICAM-1、COX-2、iNOS等表达增加，进而导致肾脏、心肌等组织受损。NF-κB的激活可能是导致胰岛素抵抗大鼠肾脏病变、心肌病变的始动因子之一，在糖尿病肾脏病变和心肌病变的发生发展中可能有重要意义。
　　 第三部分格列喹酮干预治疗对糖尿病大鼠肾脏组织及NF-κB与炎症因子表达的作用。
　　 目的：探讨格列喹酮干预治疗对糖尿病肾脏病变中肾小球病理改变的影响以及对核因子-κB、环氧合酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。
　　 方法：8月龄雄性Wistar大鼠24只随机分成对照组、糖尿病组、格列喹酮干预组，每组各8只大鼠。对照组大鼠使用普通饮食喂养，糖尿病大鼠采用高糖高脂饮食+腹腔注射链脲菌素制备。格列喹酮干预组在糖尿病大鼠成模后给予格列喹酮喂养干预。喂养2月后处死大鼠，留取各组大鼠肾脏标本，观察肾脏病理改变.使用免疫组化方法检测肾脏NF-κBP65、COX-2和iNOS等表达情况.使用RT-PCR检测肾脏组织NF-κB、COX-2和iNOS等mRNA表达情况。应用EMSA方法检测肾脏组织NF-κB激活情况。应用Westernblot方法检测各组大鼠肾脏组织NF-κB蛋白表达。
　　 结果：1.糖尿病组大鼠在腹腔注射链脲菌素一周后测两次随机血糖均≥16.7mmol/1，提示模型成功建立。2.从病理切片观察，与对照组相比，糖尿病组和格列喹酮干预组大鼠均有不同程度肾脏受损表现，其中糖尿病组病理改变最为明显。3.免疫组化分析结果显示与正常对照组相比，糖尿病组肾脏NF-κB及COX-2、iNOS等表达均增加(p<0.05)。4.RT-PCR结果显示与正常对照组相比，糖尿病组、格列喹酮干预组肾脏组织NF-κB及下游炎症因子mRNA水平表达增加(p<0.05)。5.EMSA结果显示糖尿病组肾脏组织NF-κBDNA结合力较对照组明显增强(p<0.05)，格列喹酮干预组NF-κBDNA结合力较糖尿病组明显减弱(P<0.05)。6.Westernblot结果显示糖尿病组及格列喹酮治疗组NF-κB蛋白表达水平较正常组显著升高，格列喹酮治疗后NF-κB蛋白表达水平较糖尿病组明显下降(p<0.05)。
　　 结论：NF-κB的激活及其启动的下游炎症因子在糖尿病肾脏病变的发生发展中起着重要作用，格列喹酮干预治疗则可以抑制NF-κB的激活及相应炎症因子的表达，从而间接起到肾脏保护作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略语词汇表

声明

第一部分 实验性胰岛素抵抗大鼠模型的建立

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 核因子κB及下游炎症因子在胰岛素抵抗大鼠肾脏、心脏组织中的表达

前言

材料和方法

结果

参考文献

第三部分 格列喹酮干预治疗对糖尿病大鼠肾脏组织及NF—κB与炎症因子表达的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述NF—κB与糖尿病关系的研究进展

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